聚甲基丙烯酸酯類陽離子聚合物側(cè)鏈親疏水性對基因轉(zhuǎn)染的影響.pdf

1、基因治療是指將外源性的基因物質(zhì)輸送到靶細(xì)胞中，通過表達(dá)特定的治療蛋白或阻斷致病蛋白的表達(dá)，從而達(dá)到治療目的的一種治療手段。由于其高療效與低毒副作用的特點，已被證實極具潛力?；陉栯x子脂質(zhì)體與陽離子聚合物的非病毒基因載體擁有無免疫原性、DNA不與宿主細(xì)胞染色體整合、便于修飾等優(yōu)點，但與病毒基因載體相比，其最大的劣勢在于轉(zhuǎn)染效率仍顯不足，這大大限制了非病毒基因載體在臨床上的應(yīng)用。
　　非病毒基因載體，無論是陽離子脂質(zhì)體還是陽離子聚合物

2、，都通過帶正電的載體與帶負(fù)電的核酸之間的靜電相互作用形成納米復(fù)合物，這不僅可以避免核酸與細(xì)胞膜之間的靜電排斥作用還可以保護核酸免受核酸酶的降解。另一方面，當(dāng)納米復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞后，又面臨溶酶體逃逸、DNA與聚合物解離等一系列問題，這些問題不僅僅與靜電相互作用有關(guān)，更與聚合物的親疏水性能密切相關(guān)，但聚合物的親疏水性究竟如何影響納米復(fù)合物的轉(zhuǎn)染卻沒有定論。本文第一章總結(jié)了這些方面的最新研究進(jìn)展，結(jié)合聚合物親疏水性在之前研究工作中的特點，提出聚

3、合物的親疏水性需要兼顧納米復(fù)合物的溶酶體逃逸與解離能力。
　　在本文第二章中，設(shè)計了三種不同親疏水性的帶有三級胺官能團的甲基丙烯酸酯單體，通過三者之間的均聚或共聚反應(yīng)，得到了一系列具有不同親疏水性的陽離子聚合物，研究了系列聚合物與DNA的相互作用，確定了它們形成穩(wěn)定納米復(fù)合物的條件，并在HeLa、A549與SW480三個細(xì)胞系中以bPEI25k與PDMAEMA為對照，進(jìn)行了Luciferase與EGFP的轉(zhuǎn)染實驗，總結(jié)出了不同親疏

4、水性能聚合物轉(zhuǎn)染能力的規(guī)律。之后，利用FRET技術(shù)，使用激光共聚焦顯微鏡探究了HeLa細(xì)胞中不同聚合物與DNA的解離情況，發(fā)現(xiàn)B75D25聚合物能夠快速地與DNA有效解離是其轉(zhuǎn)染能力高的重要原因。
　　此外，非病毒基因載體在進(jìn)行基因治療時，低劑量DNA下的轉(zhuǎn)染能力低下是限制其臨床應(yīng)用的重要原因。由于受體內(nèi)藥代動力學(xué)機制影響，非病毒載體到達(dá)靶細(xì)胞的基因量往往較低，因此低劑量DNA下的高效表達(dá)的意義十分重大，它不僅可以減少基因治療時的

5、核酸用量，更重要的是能夠保障活體水平的治療效果并降低治療的毒副作用。
　　因此在第三章，對B75D25陽離子聚合物在低劑量DNA下的Luciferase與EGFP表達(dá)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，其單位DNA表達(dá)蛋白的能力并不隨DNA用量的下降而下降，而對照組的PEI與PDMAEMA呈現(xiàn)數(shù)量級的下降趨勢。通過對B75D25納米復(fù)合物入胞途徑的進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)與PEI及PDMAEMA等納米復(fù)合物通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞最后被困于溶酶體不同，

6、B75D25納米復(fù)合物通過巨胞飲通路進(jìn)入細(xì)胞，巨胞飲體漏隙結(jié)構(gòu)導(dǎo)致的納米復(fù)合物逃逸很有可能是其低劑量DNA下高效表達(dá)的原因。隨后對不同親疏水性能的系列聚合物在低劑量DNA下的表達(dá)能力進(jìn)行了探究，并使用molinspiration模擬計算量化了各個聚合物的親疏水性能，發(fā)現(xiàn)了聚甲基丙烯酸酯類陽離子聚合物側(cè)鏈親疏水性能與低劑量DNA下表達(dá)能力的規(guī)律。
　　在第四章中，為了進(jìn)一步降低細(xì)胞毒性，并改善血液循環(huán)，使用了三種不同的陰離子聚合物(

7、γ-聚谷氨酸，透明質(zhì)酸鈉與肝素鈉）包裹了B75D25納米復(fù)合物，以遮蔽其正電性，并對轉(zhuǎn)染能力進(jìn)行了測定，發(fā)現(xiàn)γ-PGA包裹后的納米復(fù)合物表面電荷呈現(xiàn)負(fù)電，但仍在谷氨酸受體GGT陰性表達(dá)的HeLa細(xì)胞上保持了與包裹前相同水平的轉(zhuǎn)染能力，并保持了低劑量下高轉(zhuǎn)染能力的特性。進(jìn)一步的研究表明，γ-PGA/B75D25/DNA納米復(fù)合物也是通過巨胞飲通路進(jìn)入細(xì)胞。隨后在荷瘤裸鼠模型上通過靜脈注射給藥對HeLa移植瘤模型進(jìn)行了基因治療，與陽性對照組

8、PEI/pTRAIL相比，γ-PGA/B75D25/pTRAIL納米復(fù)合物表現(xiàn)出了較好的抑瘤效果(p＜0.01)。
　　第五章，使用伯胺與亞磷酸酯的特異性反應(yīng)合成了一種聚磷酯樹狀大分子，并使用磷酰膽堿兩性離子修飾獲得了水溶性的第四代聚磷酯樹狀大分子。聚磷酯樹狀大分子能夠在磷酯酶C存在下降解，載入阿霉素后在阿霉素耐藥細(xì)胞系MCF-7/ADR細(xì)胞中的藥物富集相對小分子藥物阿霉素有顯著提升。在裸鼠MCF-7/ADR移植瘤模型上，通過尾靜