10749.白僵菌紫外線誘變選育及菌株退化的遺傳分析

1、分類號(hào)：墨Z魚密級(jí)：壘Ⅱ白僵菌紫外線誘變選育又人世目的遺傳分析單位代碼：!QQ墨魚學(xué)號(hào)：2Q!!笪窆及菌株退化UltravioletRayMutationBreedingandGeneticAnalysisofBeauveriabassianaStrains7Degradation學(xué)位申請(qǐng)人：岳素紅指導(dǎo)教9幣：學(xué)科專業(yè)：學(xué)位類別：授予單位：答辯日期：黃大莊教授李會(huì)平副教授森林保護(hù)農(nóng)學(xué)碩士河北農(nóng)業(yè)大學(xué)二。一四年五月二十九日摘要白僵菌Bea

2、uveriabassiana是一種重要的廣譜蟲塵真菌。然而在研究和應(yīng)用過(guò)程中出現(xiàn)的菌株退化問(wèn)題嚴(yán)重影響了應(yīng)用白僵菌進(jìn)行害蟲生物防治的應(yīng)用效果，也是許多科研工作者多年來(lái)致力于解決的問(wèn)題。本研究采用紫外線誘變的方法篩選桑天牛高毒力株及耐吡蟲啉突變株，并采用PFLP分子標(biāo)記、ITS序列分析及酯酶同工酶技術(shù)研究白僵菌退化的遺傳學(xué)原因，主要結(jié)果如下：(1)桑天牛幼蟲高毒力白僵菌菌株紫外線誘變選育利用紫外線對(duì)前期篩選出的白僵菌菌株Bb00進(jìn)行誘變選

3、育，選出高幾丁質(zhì)酶突變株，再利用該突變株測(cè)定其對(duì)桑天牛幼蟲的致病力，獲得毒力高于出發(fā)菌株的突變株Bb00—3和Bb004。其中突變株Bb003經(jīng)繼代培養(yǎng)6次后，每代的產(chǎn)孢量始終高出相應(yīng)代數(shù)出發(fā)菌株的2倍以上，繼代過(guò)程中亦沒(méi)有出現(xiàn)致病力的明顯降低，表現(xiàn)出較好的遺傳穩(wěn)定性。(2)球孢白僵菌耐吡蟲啉突變株的紫外線誘變選育在含吡蟲啉的含藥培養(yǎng)基上，利用紫外線對(duì)前期篩選出的白僵菌菌株Bb00進(jìn)行誘變選育，分離篩選到抗吡蟲啉的突變菌株Bb00一uV

4、Yl、Bb00一UVY4和Bb00一uvY7，三個(gè)菌株對(duì)吡蟲啉的敏感性明顯降低，EC50分別為原始菌株的1335、1240和884倍。四種常用殺蟲劑阿維菌素、毒死蜱、滅幼脲和氯氰菊酯與突變株Bb00一UVYl和Bb00UVY7的交互抗性更好，抑制率分別在308～1210％和280—1021％之問(wèn)?？顾幏€(wěn)定性分析表明，突變菌株Bb00一uVYl和Bb00一uVY7經(jīng)連續(xù)6次轉(zhuǎn)接后，對(duì)吡蟲啉的敏感性變化不大，表明隨著傳代培養(yǎng)其耐藥性能夠穩(wěn)定

5、遺傳。(3)白僵菌菌株退化的RFLP及ITS序列分析對(duì)本實(shí)驗(yàn)用真菌的通用引物ITS4，ITS5對(duì)經(jīng)過(guò)繼代培養(yǎng)的第l、4、6、8、lO、12、14、16、18和20代菌株進(jìn)行特異性擴(kuò)增，10代菌株均擴(kuò)增出長(zhǎng)度約580bp左右的目的片段，然后用限制性內(nèi)切酶AluI、BstXI、Ecor1年UDraII對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行限制性酶切，產(chǎn)生酶切圖譜，發(fā)現(xiàn)酶切rDNA—ITS序列的RFLP圖譜差異很小，不適宜用來(lái)作為鑒定白僵菌早期退化的標(biāo)準(zhǔn)。將PCR擴(kuò)

6、增產(chǎn)物委托上海生物有限公司進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)球孢白僵菌不同傳代菌株的ITS序列具有多態(tài)性，菌株的rDNAITS序列在第080bp和第559～570bp有堿基替換，序列的一致性達(dá)9712％。可利用ITS—RFLP技術(shù)和擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果相結(jié)合的方法進(jìn)行球孢白僵菌菌株退化的早期遺傳檢測(cè)。(4)白僵菌菌株退化的酯酶同工酶比較分析本實(shí)驗(yàn)利用酯酶同工酶技術(shù)分析各代白僵菌株在蛋白質(zhì)水平的變異情況，結(jié)果表明：隨著傳代次數(shù)的增加，主要酶帶一直存在且酶譜類型未