農(nóng)桿菌介導(dǎo)的紫花苜蓿BADH基因高效轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化和轉(zhuǎn)基因植株的檢測(cè).pdf

1、土壤鹽漬化是一個(gè)世界性問(wèn)題,是影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境的一個(gè)非常重要的非生物脅迫因素.如何利用大面積的鹽堿地,提高作物耐鹽性是生物科學(xué)的一個(gè)重要研究課題.苜蓿是一種被譽(yù)為"牧草之王"的多年生優(yōu)質(zhì)豆科牧草,它不僅營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高,適口性好,適應(yīng)性強(qiáng)、抗寒耐旱,是全世界廣為種植的優(yōu)良牧草,而且對(duì)生態(tài)環(huán)境治理、固土護(hù)坡、防止水土流失起到非常重要的作用.如何進(jìn)一步提高其耐鹽抗旱特性,擴(kuò)大其種植范圍,是當(dāng)前苜蓿生產(chǎn)面臨的重要研究課題,基因工程的發(fā)展和應(yīng)用

2、為苜?？果}育種開(kāi)辟了一條新的途徑.本實(shí)驗(yàn)是苜?？果}堿育種研究課題的一部分,是在已建立的苜蓿高頻組培再生體系的基礎(chǔ)上,進(jìn)行了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甜菜堿醛脫氫酶基因轉(zhuǎn)化的進(jìn)一步研究.主要結(jié)果如下:1.優(yōu)化了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的苜蓿高效遺傳轉(zhuǎn)化體系.本試驗(yàn)在已有工作的基礎(chǔ)上,對(duì)轉(zhuǎn)化體系各因子進(jìn)行了優(yōu)化,確定了Cef最適濃度為400mg/L,Kan最適濃度為50mg/L;以GUS陽(yáng)性發(fā)生率和抗性愈傷組織率為轉(zhuǎn)化指標(biāo)探討了不同苜?；蛐?、不同外植體類型和外植體的

3、不同生理狀態(tài)對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響,并選取轉(zhuǎn)化效率高的基因型作為主要受體,侵染15天左右的葉片;在其它因子條件的優(yōu)化中,適宜的菌液濃度OD<,600>值為0.3-0.5,侵染時(shí)間15-20分鐘,無(wú)預(yù)培養(yǎng),共培養(yǎng)3-4天,在農(nóng)桿菌液體培養(yǎng)基及共培養(yǎng)基中都加入乙酰丁香酮(10mg/L)的處理方式比較好,侵染效率比較高.2.轉(zhuǎn)化植株的PCR檢測(cè).轉(zhuǎn)化研究中獲得了大量Kan抗性愈傷組織,愈傷組織分化出再生植株后,提取其DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng),以PC

4、R-Southern確定擴(kuò)增出來(lái)的條帶為特異性條帶,在145個(gè)檢測(cè)株系中,共獲得34個(gè)呈陽(yáng)性反應(yīng)的株系.結(jié)果表明BADH基因已成功的轉(zhuǎn)入苜?；蚪M中.3.轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性試驗(yàn).組培條件下的抗鹽梯度實(shí)驗(yàn)表明:未轉(zhuǎn)基因植株在鹽濃度達(dá)到0.7﹪時(shí)就停止生長(zhǎng),超過(guò)0.9﹪植株大部分已白化死亡,而轉(zhuǎn)基因植株在鹽濃度0.7-0.9﹪時(shí)基本能正常生長(zhǎng),在1.2﹪鹽害脅迫時(shí)出現(xiàn)明顯受害癥狀,表現(xiàn)為植株停止生長(zhǎng)和葉片白化.由此說(shuō)明BADH基因在轉(zhuǎn)化植株