11995.粘質(zhì)沙雷氏菌磷脂酶a2基因的克隆表達及應用

1、分類號：UDC：密級：壘匠編號：——粘質(zhì)沙雷氏菌磷脂酶A2基因的克隆表達及應用Cloning，ExpressionandApplicationofPhosphoUpaseA2GeneFtomSerratiamarcescens學位授予單位及代碼：量壹堡王盔堂(!Q!璺魚2研究方向：玉扭生塑麴鲞撾抖申請學位級別：亟指導教師：邃垡塾援研究生：型攫論文起止時間：呈Q1211Q二坌Q!墨!!至摘要粘質(zhì)沙雷氏菌(Smarcescens)能夠分泌一

2、種非特異性的磷脂酶A2，磷脂酶A2主要靠Ca2在體內(nèi)分布?？煞譃榉置谛?PL也一I和PLA2一II)和胞質(zhì)型(PLA2—12I和PL舵一Ⅳ)兩種。本文從粘質(zhì)沙雷氏菌中首次成功克隆出磷脂酶A2基因(plA2)，與pUCm—T載體連接，構(gòu)建克隆載體pUCmTplA2。測序正確后，構(gòu)建表達載體pET15bplA2并測序。將重組表達質(zhì)粒pET15bplA2，轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)，IPTG誘導表達，對表達條件進行了優(yōu)化。經(jīng)SDS—PAGE電泳

3、鑒定，分子質(zhì)量約為27KD，主要以包涵體形式存在。優(yōu)化表達條件，確定最優(yōu)條件為：pH65，37。C培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接量1：60，IPTG終濃度04mM，誘導6h，采用Ni純化柱。對純化后的樣品進行了活性測定，其酶比活為137U／mg。分別以大豆卵磷脂和動物卵磷脂作為底物測定重組磷脂酶的Km值分別為：0059mM和0124mM，確定重組磷脂酶的最適底物為大豆卵磷脂。對不同底物濃度、PH、緩沖液離子強度的重組磷脂酶的活性進行了分析，確定底物濃度7％