菊花磷脂酶基因CmPLDα的克隆與功能驗(yàn)證.pdf

1、磷脂酶D(PhospholipaseD，PLD，EC3.1.4.4)是催化磷脂分子中磷酸二酯鍵水解和堿基交換的一類酶。據(jù)研究報(bào)道，PLD不僅作為功能蛋白參與磷脂水解基團(tuán)的轉(zhuǎn)移，其水解產(chǎn)物如磷脂酸（phosphatidic acid, PA）、二酯酰甘油（diacylglycerol，DAG）、游離脂肪酸（free fatty acid, FFA）等與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)，進(jìn)而參與脅迫應(yīng)答或發(fā)育調(diào)控。菊花（Chrysanthemum morifo

2、lium Ramat.）是我國(guó)十大傳統(tǒng)名花及世界四大切花之一，干旱脅迫嚴(yán)重危害菊花的產(chǎn)量與品質(zhì)。近年，隨著分子生物學(xué)和生物信息學(xué)的發(fā)展，菊花中也發(fā)掘了多種抗逆基因及轉(zhuǎn)錄因子，但多集中在轉(zhuǎn)錄因子參與抗逆的調(diào)控路徑信號(hào)的研究。然而，在磷脂酶參與菊花抗逆方面的研究尚未見報(bào)道。為此，本研究克隆了CmPLDa基因，分析了其表達(dá)特性，通過轉(zhuǎn)基因手段創(chuàng)制了耐旱菊花新種質(zhì)，為磷脂酶介導(dǎo)菊花脅迫應(yīng)答分子機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)論如下:
　　1.

3、菊花CmPLDα基因的克隆與序列分析
　　通過簡(jiǎn)并引物、RT-PCR和RACE方法克隆出切花菊‘神馬’的磷脂酶Dα基因的全長(zhǎng)序列，命名為CmPLDα。序列分析表明:CmPLDα全長(zhǎng)2697bp，其中開放閱讀框(ORF)長(zhǎng)為2427bp，編碼809個(gè)氨基酸。氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，CmPLDα氨基酸序列存在典型的PLD家族HKD結(jié)構(gòu)域、C2結(jié)構(gòu)域，并且CmPLDα氨基酸序列與已知的磷脂酶D氨基酸序列同源性高達(dá)83％-88％。通過構(gòu)建系統(tǒng)

4、進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，CmPLDα與向日葵HaPLDα的親緣關(guān)系最近，其從屬于PLDα家族。
　　2.菊花CmPLDα基因的表達(dá)特性分析
　　利用熒光定量的方法分析了CmPLDα的組織表達(dá)特性及其在非生物脅迫、脫落酸(ABA)、蚜蟲、黑斑病接種處理下的表達(dá)特性。結(jié)果表明:CmPLDα在根、莖、葉、花等組織均有表達(dá)，在莖、葉、花中表達(dá)量較高，在根中表達(dá)較低;CmPLDα的表達(dá)幾乎不受低溫影響，整體上受機(jī)械損傷抑制，受高溫明顯抑制，受缺磷

5、和蚜蟲接種顯著誘導(dǎo)，干旱和鹽脅迫誘導(dǎo)了脅迫后期CmPLDα的增加，CmPLDα受ABA處理快速誘導(dǎo);黑斑病菌接種也可誘導(dǎo)CmPLDα的表達(dá)。由此可知，CmPLDα可能參與了菊花多種脅迫過程，包括溫度、干旱、缺磷、ABA信號(hào)、蚜蟲及黑斑病等。
　　3.菊花CmPLDα基因的遺傳轉(zhuǎn)化研究
　　構(gòu)建CmPLDα基因的正義表達(dá)載體和反義表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行菊花 CmPLDα基因遺傳轉(zhuǎn)化。經(jīng)PCR和qRT-PCR檢測(cè)，篩選出

6、正反義轉(zhuǎn)基因株系Z1、Z2和F1、F2。對(duì)轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行20％ PEG6000模擬干旱脅迫處理以鑒定其抗旱性。結(jié)果表明，正義株系植株在干旱脅迫后其存活率為野生型的1.7至1.8倍，耐旱性增強(qiáng)。正義株系相對(duì)含水量高于對(duì)照近10％，電導(dǎo)率及MDA含量則顯著低于野生型，說明正義株系細(xì)胞膜完整度及穩(wěn)定性高于野生型。轉(zhuǎn)基因反義株系F1、F2大部分植株萎蔫皺縮，萎蔫指數(shù)分別為5和6，恢復(fù)生長(zhǎng)后存活率低于野生型。反義株系則比正義株系的含水量要低，電導(dǎo)