粘質(zhì)沙雷氏菌幾丁質(zhì)酶對(duì)蜜蜂狄斯瓦螨的防治研究.pdf

1、狄斯瓦螨(Varroa destructor，簡(jiǎn)稱(chēng)大蜂螨)是威脅世界養(yǎng)蜂業(yè)最大的蜜蜂病害。目前，主要采用化學(xué)藥物防治大蜂螨，其導(dǎo)致了嚴(yán)重的環(huán)境污染和抗藥性問(wèn)題。養(yǎng)蜂業(yè)急需大蜂螨替代防治方法，期待環(huán)境友好的蜜蜂螨害防治新技術(shù)。 本論文從中華蜜蜂(Apis cerana，簡(jiǎn)稱(chēng)中蜂)腸道中分離到一株具有殺螨作用的粘質(zhì)沙雷氏菌(Serrantia marcescens)，克隆和表達(dá)該菌株的幾丁質(zhì)酶，確定該菌株對(duì)狄斯瓦螨的主要毒性因子是幾

2、丁質(zhì)酶，以此來(lái)探索有效防治狄斯瓦螨的新措施。 本研究首先從中華蜜蜂工蜂體表、腸道、花粉和蜂巢中分離伴生微生物，共得到28株細(xì)菌和32株真菌。在實(shí)驗(yàn)室條件下篩選到一株能致死狄斯瓦螨的細(xì)菌，經(jīng)鑒定為粘質(zhì)沙雷氏菌GEI菌株。 研究發(fā)現(xiàn)，具有殺螨作用的粘質(zhì)沙雷氏菌株的菌液，菌液上清以及通過(guò)硫酸銨沉淀收集的上清液蛋白表現(xiàn)出很強(qiáng)的殺螨能力，5天內(nèi)螨的死亡率達(dá)到100％。100℃加熱10 min或者蛋白酶K處理收集的沉淀蛋白導(dǎo)致殺螨能

3、力喪失，由此推測(cè)殺螨物質(zhì)可能是存在于菌液上清中的蛋白質(zhì)。培養(yǎng)基中加入幾丁質(zhì)(0.2％ w/v)誘導(dǎo)培養(yǎng)，提高了上清沉淀蛋白的幾丁質(zhì)酶活力和殺螨能力，初步證明幾丁質(zhì)酶參與了殺螨作用。 從該菌株中克隆幾丁質(zhì)酶chiA，chiB和chiCl，構(gòu)建大腸桿菌重組表達(dá)載體pET—32a(+)—chiA，pET—32a(+)—chiB，pET—32a(+)—chiCl，并在IPTG的誘導(dǎo)下在大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行大量表達(dá)，SDS—P

4、AGE電泳和幾丁質(zhì)酶的活力檢測(cè)都表明幾丁質(zhì)酶基因得到了表達(dá)。復(fù)性后的幾丁質(zhì)酶ChiA，ChiB和ChiCl的酶活力分別為15.9 U/ml，14.5 U/ml14.7 U/ml，5天后，蜂螨的死亡率分別為40.0％，40.0％，25.0％。幾丁質(zhì)酶ChiA和ChiB的組合表現(xiàn)出酶活力和殺螨能力的協(xié)同效應(yīng)，組合的酶活力是ChiA或ChiB酶活力的兩倍(34.8 U/ml)，螨的死亡率也達(dá)到了93.3％。證明幾丁質(zhì)酶具有很好的抗螨效果。