應(yīng)用DNA微陣列技術(shù)對洛克沙砷處理肉雞后肝臟和胸肌組織基因表達(dá)譜的研究.pdf

1、DNA芯片又被稱為DNA微陣列(Microarray),這項上世紀(jì)90年代中期發(fā)展起來的新興生物技術(shù),目前已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)的各個領(lǐng)域.洛克沙砷作為一種人工合成的有機(jī)砷化物,被大量用作動物促生長添加劑添加到畜禽飼料中.為了研究洛克沙砷促進(jìn)肉雞生長及其毒性的作用機(jī)制,我們首先建立了絲毛烏骨雞胸肌組織和肝臟組織的2個cDNA文庫,并經(jīng)大規(guī)模的基因測序和生物信息學(xué)分析,得到在胸肌組織中表達(dá)的基因6023個,肝臟組織中表達(dá)的基因4839個.我

2、們將兩個文庫的非冗余基因10862文庫中挑出,經(jīng)大量PCR擴(kuò)增、純化和電泳檢測,除去未擴(kuò)增出的序列和含有多條帶的污染序列,最終得到9216條高質(zhì)量的cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物,并將這些序列用于DNA芯片的點制.由于影響DNA芯片質(zhì)量的因素很多,為了得到最佳的芯片制作和雜交效果,我們對影響芯片的各種參數(shù)條件作了進(jìn)一步的優(yōu)化.用SpotBot<'TM>芯片點樣儀對4種不同的點樣液(3×SSC、50﹪的DMSO、3×SSC+1.5M甜菜堿以及MSP)和

3、5個不同公司生產(chǎn)的7種芯片片基(UltraGAPS<'TM>、GAPSⅡ、SuperAmine、SuperAmine Barcoded、Baio氨基玻片、PL-100C多聚-L-賴氨酸片和POLY-PREP<'TM>片基)進(jìn)行了比較分析,發(fā)現(xiàn)UltraGAPS<'TM>、GAPSⅡ、 SuperAmine、SuperAmine Barcoded4種片基用3×SSC+1.5M甜菜堿能得到最佳的點樣和雜交結(jié)果.為了探究洛克沙砷促生長作用的分

4、子機(jī)理,我們將112只3周齡隱性白羽農(nóng)大系肉雞作了4個分組處理,各組日糖果依次添加45mg/kg、600mg/kg、0mg/kg的洛克沙砷.數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn),4個分組在第4、5、6周的單周凈增重和累積凈增重的差異彼此都達(dá)到了顯著水平(p<0.05);累積體重除第4周的300mg/kg組和對照組之間的差異不顯著外,其余的也都達(dá)到了顯著水平(p<0.05).第4周到第7周的飼料轉(zhuǎn)化效率以45mg/kg料組最高(2.29),對照組次之(2.3

5、8),再次是300mg/kg料組(2.42)和600mg/kg料組(2.62).該試驗說明,在肉雞飼料中添加適量的洛克沙砷,可以持續(xù)顯著地加快肉雞的生長速度,提高肉雞的飼料轉(zhuǎn)化效率;但過量添加時則會顯著抑制肉雞的生長.為了研究洛克沙砷的殘留作用與基因表達(dá)之間的關(guān)系,我們應(yīng)用原子熒光吸收法對肝臟和胸肌組織以及飼料中的總砷含量進(jìn)行了測定.對于適量洛克沙砷能促進(jìn)肉雞生長的分子機(jī)理以及過量洛克沙砷對肉雞的毒性機(jī)制,我們進(jìn)一步利用DNA芯片進(jìn)行分

6、析.利用我們優(yōu)化的芯片條件,即用SpotArray72型點樣儀將純化的cDNA以Betaine+3×SSC作為點樣液,22℃的點樣環(huán)境溫度,40-45﹪的相對濕度,用UltraGAPS<'TM>和SuperAmine片基,每個樣品在每張芯片上點兩個重復(fù),180μm的點距,24×24亞陣列進(jìn)行芯片的點制.以4~7周對照組和處理組的肝臟和胸肌作為芯片分析的實驗材料,分別提取完整的總RNA,并將來自同一處理、同一組織、同一時間段的總RNA混合

7、成池.以間接標(biāo)記法標(biāo)記和純化探針,然后與芯片雜交,另以反色重復(fù)作為芯片之間的重復(fù).雜交后的芯片用ScanArray4000掃描儀掃描得到雜交圖像,再用QuantArray分析軟件對圖像進(jìn)行分析處理,導(dǎo)出雜交信號原始數(shù)據(jù),進(jìn)一步對數(shù)據(jù)作標(biāo)準(zhǔn)化處理得到Cy3/Cy5或者Cy5/Cy3的比值.為了對數(shù)據(jù)作更精確的分析,我們將QuantArray導(dǎo)出的原始分析數(shù)據(jù)導(dǎo)入GeneSpring芯片專門分析軟件作進(jìn)一步的處理和分析.經(jīng)過分析得到了芯片上

8、所有基因的聚類圖譜和表達(dá)圖譜,并初步得到了每張芯片上表達(dá)差異的基因.我們首先將來自肝臟組織和胸肌組織4~6周處理組與對照組比較雜交的36張芯片進(jìn)行了聚類分析,得到了基因在兩種組織中表達(dá)的聚類圖譜;進(jìn)一步分析得到了所有基因在這36張芯片上的曲線表達(dá)圖譜.通過同時對肝臟組織和胸肌組織基因的聚類和表達(dá)分析,我們可以同時知道某一特定基因在所有時間段和所有劑量處理條件下的表達(dá)情況.另外,我們還分別對肝臟和胸肌基因表達(dá)的數(shù)據(jù)作了分析,得到了肝臟和胸