玉米中類似于mRNA的非編碼基因ZM401 cDNA的克隆及其在玉米花粉發(fā)育中的作用.pdf

1、隨著人類及擬南芥基因組序列的完成,對許多新的編碼蛋白基因以及tRNA,rRNA,snRNAs基因的結(jié)構(gòu)及功能給出了注釋.但是真核生物基因組中只有一小部分為蛋白編碼序列,而絕大部分則是不具有編碼蛋白能力的非編碼序列.對于大部分的非編碼序列,其功能及其在基因組中存在的意義知之甚少.近年來科學(xué)家發(fā)現(xiàn)一類類似于mRNA,有mRNA的基本特征,但缺乏明顯開放閱讀框架的基因,它們主要以RNA分子的形式參與許多基本的生命活動,如胚胎發(fā)育,染色體失活,

2、轉(zhuǎn)錄調(diào)控,生長發(fā)育及對脅迫的應(yīng)答.該研究小組通過差異篩選法,并結(jié)合冷噬菌斑篩選,從玉米成熟花粉cDNA文庫中克隆到一個玉米花粉特異表達(dá)的非編碼基因cDNA片段ZM401(663bp).Northern雜交表明ZM401是一個玉米花粉特異表達(dá)的基因.該文采用5'RACE,6'RACE技術(shù)及重疊PCR獲得了ZM401cDNA的全長(1149bp).采用生物學(xué)軟件對ZM401cDNA的全長序列和結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,該基因缺乏明顯的開放閱讀框架,序列

3、中最長的可能的開放閱讀框架僅編碼89個氨基酸,具有poly(A)尾部結(jié)構(gòu),軟件分析表明RNA分子具有穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu),符合非編碼RNA基因的特點(diǎn),屬于類似于mRNA的非編碼基因這一類.RT-PCR分析表明ZM401基因從玉米花粉發(fā)育的四分體時(shí)期,單核期,雙核期,成熟花粉均有表達(dá),Northern Blot雜交結(jié)果表明ZM401從四分體時(shí)期,單核期,雙核期,成熟花粉表達(dá)量依次增強(qiáng),證明ZM401屬于玉米花粉發(fā)育晚期基因.同時(shí),Norther

4、n雜交顯示ZM401基因在玉米花粉發(fā)育中以兩種轉(zhuǎn)錄本形式存在.Southern雜交表達(dá)ZM401基因在玉米基因組中可能以單拷貝或低拷貝形式存在.該文將四種分別在35S啟動子或ZM13啟動子驅(qū)動下的正向與反向植物表達(dá)載體通過基因槍法導(dǎo)入玉米胚性愈傷,經(jīng)分子檢測共得到27株Southern陽性轉(zhuǎn)基因玉米,其中13株為轉(zhuǎn)入正向表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因玉米,14株為轉(zhuǎn)入反向表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因玉米.通過對轉(zhuǎn)基因玉米花藥形態(tài)的觀察及花粉活力的測定,表明ZM4

5、01以正向方式整合的轉(zhuǎn)基因玉米花藥出現(xiàn)退化或皺縮現(xiàn)象,花粉經(jīng)I<,2>-KI染色后,明顯可見淀粉積累減少,花粉形態(tài)異常且大小不一.染黑率在1.2％-18.2％之間.轉(zhuǎn)入反向表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因玉米花藥未見異常現(xiàn)象,花粉經(jīng)I<,2>-KI染色后,花粉形態(tài)正常,黑染率在60％以上.通過對轉(zhuǎn)正向表達(dá)載體轉(zhuǎn)基因玉米花藥的顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察,表明由于ZM401的插入,導(dǎo)致出現(xiàn)以下異?，F(xiàn)象,a)花粉發(fā)育不同步,b)花粉囊發(fā)育不同步,c)絨氈層與非轉(zhuǎn)基因玉