晝夜溫差對鐵皮石斛原球莖多糖含量的影響及機理研究.pdf

1、鐵皮石斛（Dendrobium officinale），是蘭科石斛屬藥用植物，有著非常獨特的價值。本研究以鐵皮石斛原球莖為材料，探討了有利于原球莖增殖、保存及多糖積累的最佳培養(yǎng)條件，并初步建立液體培養(yǎng)系，以測定其在不同晝夜溫差下的多糖含量，在此基礎(chǔ)上克隆了多糖合成途徑中的2個關(guān)鍵的糖基轉(zhuǎn)移酶基因—DoGAUT1和DoPGSIP6基因，并對該基因在不同晝夜溫差下進行定量表達分析。主要研究結(jié)果如下：
　　1.鐵皮石斛離體培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2、
　　選取鐵皮石斛的原球莖為材料，優(yōu)化鐵皮石斛原球莖增殖與保存的離體培養(yǎng)條件。①采用單因素試驗設(shè)計，比較了6-BA、椰乳、土豆配合使用對原球莖增殖的影響，試驗數(shù)據(jù)得出1/2 MS+土豆泥50 g/L較適合鐵皮石斛原球莖增殖，添加2.0 mg/L6-BA后，原球莖鮮重增殖系數(shù)增高，但原球莖部分分化。②改變1/2 MS中KNO3、KH2PO4的比例，比較其對鐵皮石斛原球莖增殖的影響，試驗結(jié)果表明，當KNO3，KH2PO4分別為對照的0

3、.5倍，1倍時，鐵皮石斛原球莖增殖系數(shù)雖最高，但原球莖少量黃化，對照1/2 MS較適合鐵皮石斛原球莖增殖。③對比不同的硝態(tài)氮和銨態(tài)氮配比對鐵皮石斛原球莖增殖效果的影響，試驗結(jié)果表明，當KNO3，NH4NO3均為對照的0.5倍且土豆泥為50 g/L的培養(yǎng)基和1/2 MS+土豆泥50 g/L增殖系數(shù)相最高。④比較不同濃度的姜黃素和甜菜紅苷對鐵皮石斛原球莖離體保存的效果的影響，結(jié)果顯示姜黃素為0.1-1.0 g/L可以抑制原球莖生長，甜菜紅苷

4、濃度為0.1 g/L保存效果最好。⑤以誘導(dǎo)出的鐵皮石斛原球莖為材料，接種1/2 MS+土豆提取液50 g/L的液體培養(yǎng)基中，比較了不同時間下鐵皮石斛培養(yǎng)物生物量的變化，試驗結(jié)果表明，在整個生育期內(nèi)，原球莖的鮮重變化曲線為S型，30-40 d快速生長。
　　2.鐵皮石斛離體培養(yǎng)物在不同晝夜溫差處理條件下多糖含量變化
　　以誘導(dǎo)出的鐵皮石斛原球莖為材料，比較了不同時間下鐵皮石斛培養(yǎng)物多糖的變化，在整個生長周期，原球莖多糖變化曲線

5、呈S型。選取培育30 d的鐵皮石斛原球莖為材料，對比了鐵皮石斛多糖含量在不同晝夜溫差下的差異。試驗結(jié)果表明，處理溫度為25℃/10℃，處理2 d的多糖含量最高，且在一定的處理時間范圍內(nèi)，多糖含量先增加后下降的趨勢；處理溫度為25℃/15℃，該溫度下多糖的含量隨著處理時間的增加而增加，該溫差是最適合促進次生代謝物多糖積累的溫度；處理溫度為25℃/20℃，多糖含量呈遞增趨勢，略低于相同時間下溫度為25℃/15℃的處理。
　　3.鐵皮石

6、斛原球莖DoGAUT1和DoPGSIP6基因的克隆及生物信息學(xué)分析
　　應(yīng)用同源克隆與RACE技術(shù)結(jié)合，以鐵皮石斛原球莖為材料，克隆了兩個糖基轉(zhuǎn)移酶基因DoGAUT1和DoPGSIP6，全長分別為2518、2010 bp，分別編碼了705、549個氨基酸，登入號為1740985。生物信息學(xué)研究表明，DoGAUT1為親水性跨膜蛋白，不含信號肽，形成卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，亞細胞定位于高爾基體。DoPGSIP6為疏水性跨膜蛋白，含信號肽，無卷曲

7、螺旋結(jié)構(gòu)，亞細胞定位于質(zhì)膜。它們同屬于GT8家族中的GT-A類的糖基轉(zhuǎn)移酶，DoGAUT1蛋白在第394-692位含有典型的GT8_like_1未知功能的保守結(jié)構(gòu)域，多個配體結(jié)合位點、2個金屬離子結(jié)合位點。而DoPGSIP6蛋白在第29-276位含有GT8_Glycogenin保守結(jié)構(gòu)域，多個底物結(jié)合位點、2個錳結(jié)合位點和一個保守基因序列DXD，該基序主要負責(zé)將不同的糖添加到糖鏈、碳酸鹽、蛋白上。此外，DoPGSIP6蛋白在第448-5

8、22位含有CCC1_like保守結(jié)構(gòu)域，它可能具有固氮的作用。進行進化樹構(gòu)建時發(fā)現(xiàn)DoGAUT1和DoPGSIP6基因推定的氨基酸序列分別與二穗短柄草，大豆進化關(guān)系最近，而與番茄、甜橙親緣關(guān)系較遠。
　　4.鐵皮石斛DoGAUT1和DoPGSIP6基因在不同晝夜溫差下的定量表達分析
　　以18S rRNA為內(nèi)參基因，對DoGAUT1基因和DoPGSIP6基因在不同晝夜溫差下的表達水平進行相對定量表達分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，晝夜溫度為