Bt腸毒素基因的序列分析及安全性研究.pdf

1、蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，簡(jiǎn)稱Bt），從1956年開始商業(yè)化生產(chǎn)至今，已廣泛應(yīng)用于防治農(nóng)林病蟲害，是一種應(yīng)用成功的微生物殺蟲劑，它的安全性關(guān)系到全人類的健康。而與它親緣性很近的蠟狀芽胞桿菌（Bacillus cereus，簡(jiǎn)稱Bc）是眾人周知的條件致病菌，它所產(chǎn)生的腸毒素是引起腹瀉的重要因素之一，研究表明，Bt中也廣泛存在腸毒素基因。所以本課題以Bt腸毒素的安全性為出發(fā)點(diǎn)進(jìn)行一系列研究，為Bt的安全應(yīng)

2、用提供一定的理論基礎(chǔ)。
　　采用6對(duì)引物對(duì)本室保存的40株不同來源的Bt菌株腸毒素基因（ent、hblA、bceT、nheA、nheB、nheC）進(jìn)行PCR檢測(cè)。結(jié)果表明，其中30株Bt全部含有這6個(gè)基因。而在這6個(gè)被檢腸毒素基因中，nheC基因的檢出率達(dá)到100％，nheA、nheB基因的檢出率僅低于nheC基因，達(dá)到95%，檢出率最低的是bceT基因，也達(dá)到了82.5%，此外，hblA基因及ent基因的檢出率分別為87.5%、

3、90%，這說明腸毒素基因確實(shí)廣泛存在于Bt中。
　　以BRC-LLP29及BRC-XQ9為模板，克隆腸毒素基因ent、hblA、hblB、hblD、nheA的ORF。用NCBI BLAST軟件對(duì)Bt與Bc腸毒素的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)它們之間的相似度非常高，其中，二者的ent基因氨基酸序列同源性達(dá)到98%，而hblA、hblB、hblD、nheA基因的氨基酸序列與Bc同源性均達(dá)到了99%。
　　用BRC-LLP29及BRC

4、-XQ9的nheA基因體外誘導(dǎo)表達(dá)NheA-pET32a融合蛋白，并對(duì)其和出發(fā)菌株的發(fā)酵液進(jìn)行Tecra BDE VIA試劑盒檢測(cè)及小鼠急性口服試驗(yàn)，探究其表達(dá)活性和生物毒性。結(jié)果表明，含有NheA-pET32a融合蛋白的發(fā)酵液表達(dá)活性非常高，出發(fā)菌株的發(fā)酵液也被檢測(cè)到腸毒素表達(dá)活性，但是在小鼠口服試驗(yàn)中卻沒有表現(xiàn)相應(yīng)的生物毒性。隨后對(duì)小鼠進(jìn)行解剖，發(fā)現(xiàn)小鼠的胃腸粘膜光滑，沒有充血、脹氣現(xiàn)象，各臟器外形、大小比例及色澤均無異常。整個(gè)實(shí)驗(yàn)