產(chǎn)氣莢膜梭菌PCR分型與腸毒素基因的克隆及序列分析.pdf

1、產(chǎn)氣莢膜梭菌為一類(lèi)革蘭氏陽(yáng)性產(chǎn)芽孢的厭氧梭菌，是一種重要的人畜共患病病原體，本試驗(yàn)對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的研究包括四個(gè)方面：
　　1.羊源產(chǎn)氣莢膜梭菌貴州分離株多重 PCR分型研究根據(jù)產(chǎn)氣莢膜梭菌α、β、ε和ι毒素基因分別合成4對(duì)引物，建立多重 PCR分型方法，對(duì)34株羊源產(chǎn)氣莢膜梭菌貴州分離株進(jìn)行血清型鑒定，結(jié)果在羊源產(chǎn)氣莢膜梭菌貴州分離株中，屬于產(chǎn)氣莢膜梭菌 A型的有32株，屬 C型和D型的各有1株，與前期的血清學(xué)方法鑒定結(jié)果一致。表

2、明，這種多重 PCR方法可以應(yīng)用于產(chǎn)氣莢膜梭菌臨床分離株血清型的快速鑒定。
　　2.產(chǎn)氣莢膜梭菌腸毒素陽(yáng)性菌株的篩選與鑒定參考相關(guān)資料，針對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌腸毒素基因設(shè)計(jì)合成1對(duì)特異性引物，對(duì)34株貴州分離株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到 pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 DH5a感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定后測(cè)序和分析。結(jié)果在34株產(chǎn)氣莢膜梭菌貴州分離株中有1株(為C型菌株)擴(kuò)增出與預(yù)期大小相一致的目的片段，經(jīng)克

3、隆測(cè)序后，該片段大小為233 bp，其與產(chǎn)氣莢膜梭菌參考株腸毒素基因序列的核苷酸同源性為99.6％～100％，推導(dǎo)氨基酸同源性為98.7％～100％，表明所擴(kuò)增產(chǎn)物為產(chǎn)氣莢膜梭菌的腸毒素基因片段。由此可見(jiàn)，本試驗(yàn)從34株貴州分離株中篩選鑒定出一株產(chǎn)氣莢膜梭菌 cpe+菌株(為C型菌株)，為腸毒素全基因的克隆奠定了基礎(chǔ)。
　　3. C型產(chǎn)氣莢膜梭菌腸毒素基因的克隆與序列分析參照國(guó)外發(fā)表的產(chǎn)氣莢膜梭菌腸毒素全基因序列，設(shè)計(jì)合成一對(duì)特異

4、性引物，采用PCR技術(shù)對(duì)腸毒素陽(yáng)性 C型產(chǎn)氣莢膜梭菌貴州分離株（CP2株）腸毒素基因進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到 pMD18-T載體，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 DH5a感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定后測(cè)序。結(jié)果顯示，獲得的基因序列全長(zhǎng)960 bp，編碼319個(gè)氨基酸。同源性分析表明貴州分離株 CP2株與產(chǎn)氣莢膜梭菌參考株腸毒素基因序列核苷酸同源性高達(dá)99.4％～99.8％，推導(dǎo)氨基酸同源性為99.1％～99.7％。這為進(jìn)一步探討腸毒素

5、致病機(jī)理的研究奠定了分子基礎(chǔ)。
　　4.產(chǎn)氣莢膜梭菌腸毒素基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建以含C型產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株(CP2)腸毒素基因的克隆載體pMD18-T-cpe為材料，根據(jù)產(chǎn)氣莢膜梭菌開(kāi)放閱讀框設(shè)計(jì)合成一對(duì)特異性引物，采用PCR技術(shù)對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切后，從膠上回收目的基因，與經(jīng)過(guò)相同兩種內(nèi)切酶處理的原核表達(dá)載體pET32a連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR和BamHⅠ/EcoRⅠ雙酶切