外源刺激對擬南芥基因組修飾和基因表達(dá)的影響.pdf

1、病蟲害是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中重要的危害之一，現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中主要通過施用農(nóng)藥來控制病蟲害。而農(nóng)藥長期大量的施用，不僅會污染生態(tài)環(huán)境，帶來一系列生態(tài)問題，同時,農(nóng)藥殘留也給人們的健康帶來巨大危害。在此之前,大量的研究集中于農(nóng)藥施用過程中對空氣造成的污染和對操作者身體健康的影響，而關(guān)于農(nóng)藥施用到農(nóng)作物上之后,對農(nóng)作物本身所帶來的影響，卻較為缺乏。關(guān)于施用農(nóng)藥對作物DNA甲基化及基因表達(dá)的影響方面的研究更為缺乏。多菌靈是一種重要的殺菌劑，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中

2、得到了廣泛的應(yīng)用。本研究以擬南芥為材料，研究多菌靈對擬南芥親代（T0代）及子代（T1代）基因組DNA甲基化變化和基因表達(dá)的影響。以多菌靈處理擬南芥培養(yǎng)基,設(shè)置了4個濃度梯度0m mol/l(CK),0.05m mol/l（D1），0.1m mol/l(D2),0.2m mol/l(D3)。對處理材料進行了生長和生理生態(tài)檢測以及AFLP，MSAP分子標(biāo)記檢測。并對CK，D2，D3三個處理進行了基因甲基化芯片和基因組表達(dá)譜芯片分析。結(jié)果如下

3、：
　　1.多菌靈對T0代的影響
　　與對照相比,多菌靈處理20d的擬南芥植株葉片有略微增厚，卷曲的現(xiàn)象；主根顯著變短，側(cè)根明顯增多；葉片葉綠素含量有顯著增加。
　　生長20d的幼苗(不含根)DNA用AFLP法（共使用8對引物）,共擴增出776條可統(tǒng)計條帶，這些條帶中未出現(xiàn)多態(tài)性位點，說明處理組與對照組之間的基因組序列保持一致，多菌靈處理擬南芥沒有誘導(dǎo)出本方法可以檢測到的遺傳變異。
　　經(jīng)過MSAP分析，與對照相

4、比，0.05m mol/l多菌靈處理（D1）基因組DNA的甲基化率為0.862％，去甲基化率為0.69%。與對照（CK）相比，0.1m mol/l多菌靈處理（D2）基因組DNA甲基化率為0.871%，去甲基化率為0.871%。與對照相比,0.2m mol/l多菌靈處理（D3）基因組DNA甲基化率為1.193%,去甲基化率為1.363%。
　　使用擬南芥全基因組甲基化芯片分析全基因組范圍內(nèi)基因啟動子區(qū)域甲基化情況發(fā)現(xiàn)，對照CK有甲基

5、化區(qū)域6671個，D2有甲基化區(qū)域6690個，D3有7193個。其中D2相對于對照發(fā)生甲基化增加的區(qū)域有1541個,去甲基化的區(qū)域有1522個，甲基化率為0.4%，去甲基化率為0.395%。D3相對于對照發(fā)生甲基化增加的區(qū)域有2790個，去甲基化的區(qū)域有2278個，發(fā)生甲基化率為0.725%，去甲基化率為0.592%。兩處理均發(fā)生甲基化增加的區(qū)域有472個，占總數(shù)的0.123%，兩處理均發(fā)生去甲基化的區(qū)域有872個，占總數(shù)的0.226%

6、。其中還發(fā)現(xiàn)有轉(zhuǎn)錄因子基因啟動子發(fā)生了甲基化變化。其中16個甲基化程度增加的，11個甲基化程度減少。
　　擬南芥基因組DNA表達(dá)譜芯片分析發(fā)現(xiàn)，多菌靈處理引起基因表達(dá)的改變，D2相對于對照表達(dá)上調(diào)2倍的基因有1618個,下調(diào)2倍的有1194個。D3相對于對照,表達(dá)上調(diào)2倍的基因有2665個，下調(diào)2倍的有3081個。一些基因的表達(dá)變化也引起相關(guān)代謝通路的變化。生物信息學(xué)功能數(shù)據(jù)庫KEGG做pathway分析，這些基因表達(dá)變化共涉及到

7、32個信號通路的變化。其中D2涉及到21個，D3涉及到25個信號通路。D2、D3均受到影響的通路有14個。
　　DNA甲基化芯片和表達(dá)譜芯片聯(lián)合分析表明,D2發(fā)生去甲基化且表達(dá)上調(diào)的基因有46個，D3發(fā)生去甲基化且表達(dá)上調(diào)的基因有80個，兩個多菌靈添加處理均發(fā)生去甲基化且表達(dá)上調(diào)的基因有21個。D2發(fā)生重新甲基化且表達(dá)下調(diào)的基因有45個，D3發(fā)生重新甲基化且表達(dá)下調(diào)的基因有71個，兩個多菌靈處理材料均發(fā)生重新甲基化且表達(dá)下調(diào)的基因

8、有3個。
　　從甲基化芯片和表達(dá)譜芯片聯(lián)合分析結(jié)果里，挑取與生長發(fā)育和逆境刺激相關(guān)的幾個基因，其發(fā)生去甲基化引起了表達(dá)上調(diào)。AN3、ATFER4、BT4、MEK1、SPL8這5個基因進行實時熒光PCR驗證分析。結(jié)果顯示,多菌靈處理的樣本中這5個基因的表達(dá)與對照相比均有不同程度的上調(diào)，這與芯片檢測結(jié)果是基本相符的。
　　經(jīng)過甲基化與表達(dá)譜數(shù)據(jù)比對分析,我們發(fā)現(xiàn)多菌靈或參與啟動擬南芥防御基因表達(dá)的路徑,多菌靈使得該途徑中初始幾個

9、關(guān)鍵基因（AT1G35710，EFR，VSR6，MEKK1，MEK1）發(fā)生去甲基化,引起其表達(dá)極顯著上調(diào),最終引起防御基因（PAD3，NUDT6，F(xiàn)RK1，NHO1）的表達(dá)大幅上調(diào),這是世界上農(nóng)藥啟動植物防御系統(tǒng)的首例報道。也是第一次比較完整的推理出多菌靈啟動植物防御系統(tǒng)的作用通路。
　　2.多菌靈處理對擬南芥子代(T1)的影響
　　多菌靈處理過的親本的子代發(fā)育正常，側(cè)根較多。而對照則發(fā)現(xiàn)污染率高，苗相對較弱。AFLP分子標(biāo)

10、記檢測，共用了8對引物，擴增出528條帶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩處理與對照相比，均未發(fā)現(xiàn)有多態(tài)性的條帶，表明親代苗經(jīng)多菌靈處理后，子代苗的基因組沒有發(fā)生本方法可檢測的DNA序列變異。
　　經(jīng)過MSAP分析，0.1m mol/l多菌靈處理（D2）的子代(D2T1)與對照（CKT1）相比，全基因組的甲基化率為0.475%，去甲基化率為0.634%。0.2m mol/l多菌靈處理（D3T1）與對照相比,甲基化率為1.08%,去甲基化率為1.235

11、%。
　　芯片分析全基因組范圍內(nèi)基因啟動子區(qū)域甲基化情況發(fā)現(xiàn)，D2T1相對于對照發(fā)生甲基化增加的區(qū)域有2218個,去甲基化的區(qū)域有3075個，D3T1相對于對照發(fā)生甲基化增加的區(qū)域有3500個，去甲基化的區(qū)域有4269個。另外，D2T1代對照相比保持與去甲基化的有591個區(qū)域,保持甲基化增加的區(qū)域有353個。D3T1代保持去甲基化的有147個區(qū)域,保持甲基化增加的有207個區(qū)域。
　　為了驗證甲基化芯片結(jié)果,挑選了在芯片分析

12、中發(fā)生去甲基化的4個基因進行了甲基化特異性PCR檢測，檢測結(jié)果表明多菌靈處理組的這4個基因均發(fā)生了去甲基化，這與芯片檢測結(jié)果是一致的。同時這4個基因的表達(dá)也發(fā)生了不同程度的上調(diào)。
　　子代多菌靈處理組與對照相比，基因表達(dá)差異也普遍存在。D2與對照相比，表達(dá)上調(diào)2倍的基因有3108個，下調(diào)2倍的有3429個；而D3與對照相比，表達(dá)上調(diào)2倍的基因有4381個，下調(diào)2倍的有4651個。
　　D2與對照相比，有30個基因在T1代保持

13、了甲基化增加并且表達(dá)水平下調(diào)2倍以上，21個基因保持了去甲基化并且表達(dá)水平上調(diào)2倍以上。D3處理與對照相比，有9個基因保持甲基化增加并表達(dá)下調(diào)，11個基因保持了去甲基化并表達(dá)上調(diào)。其中一些基因DNA甲基化與基因表達(dá)關(guān)聯(lián)性變化與親代相同。其中涉及的代謝通路與T0代基本相同。
　　由上述結(jié)果,我們還看到,雖然上一代基因的甲基化有大約5-10%遺傳給了下一代,但是卻只有大約0.5%的基因的甲基化繼續(xù)影響了該基因的表達(dá)狀況。
　　3

14、.結(jié)論
　　(1)施用多菌靈使擬南芥親代（T0）基因組DNA發(fā)生了廣泛的去甲基化和重新甲基化。
　　(2)多菌靈施用導(dǎo)致擬南芥全基因組范圍基因表達(dá)發(fā)生了顯著的變化，一些代謝途徑也因此受到顯著影響。
　　(3)多菌靈添加可能通過啟動并影響病菌與植物相互作用通路中的幾個關(guān)鍵基因去甲基化而使下游的防御基因表達(dá)上調(diào),最終達(dá)到殺死致病菌的目的。
　　(4)擬南芥子代(T1)的表型和DNA甲基化狀況仍然受到親代(T0)施用多