尼古丁對(duì)人氣道上皮基因組和蛋白組學(xué)的影響.pdf

1、目的：
　　吸煙是引起慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD）的主要原因。氣道重塑是COPD不可逆性氣流受限的主要原因。一般認(rèn)為，COPD氣道重塑的機(jī)制與炎癥細(xì)胞活化、氧化抗氧化失衡、蛋白酶抗蛋白酶失衡、細(xì)胞凋亡等有關(guān)。最近，越來(lái)越多的研究表明上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化（epithelial mesenchymal transdifferentiation,EMT）參與了氣道重塑

2、的發(fā)生。氣道上皮作為抵御外來(lái)?yè)p傷因素的第一道防線，吸入的煙草煙霧進(jìn)入人體最先直接接觸人體的氣道。尼古丁是香煙煙霧中的主要有害成分。尼古丁對(duì)氣道上皮的直接影響目前還不清楚。本研究首次采用基因芯片技術(shù)和雙向凝膠電泳技術(shù)觀察尼古丁刺激人氣道上皮細(xì)胞后差異基因和蛋白的表達(dá)情況，為進(jìn)一步闡明氣道重塑機(jī)制提供線索。
　　方法：
　　一、體外培養(yǎng)原代人小氣道上皮細(xì)胞，待原代人氣道上皮細(xì)胞生長(zhǎng)至80％融合時(shí)，換用無(wú)生長(zhǎng)因子的基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)2

3、4小時(shí)，使細(xì)胞同步于靜止期。將細(xì)胞隨機(jī)分成兩組，每組再分成兩個(gè)平行組，即尼古丁刺激4小時(shí)組和空白對(duì)照組，尼古丁刺激48小時(shí)組和空白對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組加入尼古?。?310-5M），對(duì)照組加入PBS，分別孵育4小時(shí)和48小時(shí)后吸走，加入Trizol試劑，收集細(xì)胞用于基因芯片檢測(cè)。
　　二、根據(jù)基因芯片結(jié)果，選取部分表達(dá)差異基因用熒光定量PCR方法進(jìn)行驗(yàn)證。
　　三、體外培養(yǎng)人支氣管上皮細(xì)胞16HBE,待16HBE細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合

4、時(shí)，換含1%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞同步于靜止期。采用隨機(jī)化的原則進(jìn)行分組：（1）對(duì)照組，加入PBS；（2）實(shí)驗(yàn)組，加入尼古?。ńK濃度1310-5M），孵育72小時(shí)后加入裂解液收集細(xì)胞用于雙向凝膠電泳。通過(guò)雙向凝膠電泳實(shí)驗(yàn)分離總蛋白，差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜獲取肽質(zhì)量指紋圖譜并通過(guò) NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定。
　　結(jié)果：
　　一、基因芯片結(jié)果
　　（1）尼古丁處理4h后，表達(dá)

5、上調(diào)的基因有63個(gè)，表達(dá)下調(diào)的基因有44個(gè)，主要涉及細(xì)胞對(duì)外界刺激的應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)基因。
　?。?）尼古丁處理48h后，表達(dá)上調(diào)的基因有860個(gè)，表達(dá)下調(diào)的基因有582個(gè)。對(duì)差異基因進(jìn)行Gene GO分析和Pathway分析，發(fā)現(xiàn)差異基因涉及到胚胎發(fā)育、細(xì)胞極性維持、細(xì)胞與細(xì)胞黏附等與細(xì)胞轉(zhuǎn)分化相關(guān)的重要生理過(guò)程和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
　　（3）進(jìn)一步對(duì)個(gè)別基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)尼古丁可以下調(diào)上皮角蛋白（CK）、上皮黏蛋白（MUC）等具

6、有上皮特征的基因；上調(diào)纖維連接蛋白1（FN1）、N鈣粘蛋白（N-cadherin）等具有間質(zhì)細(xì)胞特征的基因。
　　二、熒光定量PCR結(jié)果熒光定量PCR驗(yàn)證的基因差異表達(dá)與基因芯片結(jié)果變化趨勢(shì)一致。
　　三、雙向凝膠電泳結(jié)果
　　雙向凝膠電泳圖譜中找到23個(gè)表達(dá)量有明顯差異的蛋白質(zhì)點(diǎn)，質(zhì)譜鑒定出19種蛋白質(zhì)。其中與細(xì)胞骨架相關(guān)的蛋白明顯下調(diào)，如微管蛋白、γ1-肌動(dòng)蛋白等。
　　結(jié)論：
　　不論從基因組水平還是