池蝶蚌表皮生長因子受體底物15(Eps15)基因的分子特征及表達分析.pdf

1、本研究利用實驗室已有的池蝶蚌（Hyriopsis schlegelii）轉錄組數(shù)據(jù)中表皮生長因子受體底物15（Eps15）基因的部分序列，設計池蝶蚌Eps15基因(Hs-Eps15)基因的特異性引物，并以池蝶蚌性腺組織cDNA為模板進行PCR擴增。將擴增產物克隆到pMD19-T載體中，然后轉進大腸桿菌DH5α，經測序獲得Hs-Eps15基因的部分中間片段，繼而通過PCR和3’-RACE PCR最終克隆出Eps15基因序列，其cDNA全長

2、3382bp，包括923bp的3'-UTR，具有24bp長的polyA尾巴及加尾信號AATAA，開放閱讀框(Open reading frame，ORF)為2454bp，編碼817個氨基酸。對Hs-Eps15蛋白結構域分析得知，N端部分主要由三個EH(Eps15 homology)結構域組成，無信號肽，而C端部分最顯著的特征是存在多次DPF(谷氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸)重復序列；利用相關生物學軟件分析得到其分子量約為88.67kDa，理論

3、等電點為4.88；二級結構預測中顯示無規(guī)則卷曲和α-螺旋最多，分別占41.74％和41.49%，延伸鏈占9.55，β-折疊最少。采用MEGA4.0軟件鄰位相連法（NJ）建立系統(tǒng)進化樹分析同源性表明，在眾多物種中，池蝶蚌的Eps15基因與太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）的同源性最高（約64%）。
　　通過熒光定量PCR技術檢測分析Hs-Eps15基因在池蝶蚌不同組織中mRNA的表達情況。結果表明：該基因在池蝶蚌心臟、

4、卵巢、精巢、腸、肝胰腺、腎臟、鰓、閉殼肌、外套膜、斧足和血液11個組織中均有表達，其中在精巢中表達量最高，在卵巢中次之，而在心臟、鰓和血液中表達量較低，其中心臟中最低。由此推測池蝶蚌中以Eps15為底物的EGFR通路會影響精子的產生和發(fā)育，也會作為池蝶蚌卵巢局部重要的調節(jié)因子，影響卵泡生長發(fā)育及成熟。
　　根據(jù)已得到的Hs-Eps15基因的全長cDNA序列，經NCBI中比對獲知序列N端有3個EH結構域，選取這段完整且具有代表性結構

5、域的序列，并對此設計擴增該完整結構域的引物，pEASYTM-E1-Hs-Eps15重組表達質粒，然后轉進E.coil BL21(DE3)表達感受態(tài)細胞中，經IPTG誘導蛋白表達，得到了分子量約為32.6kDa的融合蛋白。采用Ni-NTA樹脂親和層析法純化表達產物，SDS-PAGE檢測顯示獲得了純凈的融合蛋白，Bradford法測定蛋白濃度及含量，測定結果顯示蛋白濃度符合制備多克隆抗體的要求。利用純化的Hs-Eps15融合蛋白作為抗原免疫

6、日本長耳兔，制備多克隆抗體，ELISA間接法檢測抗血清效價在1:512000以上。經Western blotting檢測得知制備的多克隆抗血清能夠特異性識別純化的Hs-Eps15融合蛋白。最后做池蝶蚌成熟性腺及肝胰腺的冰凍切片，用制備的兔抗血清對Hs-Eps15蛋白在細胞內表達進行免疫熒光定位，結果發(fā)現(xiàn)在池蝶蚌的精子中，Eps15蛋白主要分布在精子頭部位置，在池蝶蚌卵細胞中，Eps15蛋白主要分布在細胞核膜上，而在肝胰腺細胞中Eps15