湖北省不同地區(qū)柔嫩艾美耳球蟲的抗藥性調(diào)查.pdf

1、雞球蟲病(Coccidiosis)是由艾美耳屬的原蟲寄生于雞腸道細胞，從而引起的以腸炎、腹瀉帶血、飼料轉(zhuǎn)化率下降甚至死亡為主要特征的寄生蟲病。雞球蟲病在世界各地都有分布和流行，造成了巨大的經(jīng)濟損失，阻礙了養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展(Williams2002;Dalluouland Lillehoj2005)。迄今為止，使用化學藥物治療是生產(chǎn)中防治雞球蟲病的主要手段，但隨著抗球蟲藥越來越頻繁的使用，球蟲對藥物的抗藥性問題也隨之浮現(xiàn)。由于球蟲疫苗的研制存

2、在很多關(guān)鍵問題尚未解決（Sharmanetal2010），因此在未來相當長的時間里，使用抗球蟲藥仍是防治球蟲病的主要手段（Chapmanand Shirley2002）?？顾幮允请u球蟲病防治中最為嚴重的問題，也是亟待解決的難題。
　　在本研究中，從湖北省8個地區(qū)的23個養(yǎng)雞場采集新鮮糞便，通過雞體擴大增殖實驗分離得到20個柔嫩艾美耳球蟲野外分離株;利用PCR和RT-PCR分別擴增不同蟲株的球蟲抗藥性可能相關(guān)基因MIC2，SAG，c

3、ation-transportingATPase和Cytb，測序分析了不同蟲株之間基因的序列差異;通過籠養(yǎng)實驗，檢測了不同基因型和地理分布的蟲株對馬杜拉霉素、地克珠利和癸氧喹啉的敏感程度，分析相關(guān)抗藥基因的突變與抗藥性產(chǎn)生的關(guān)系。
　　(1)不同地區(qū)E.tenella分離株的獲得
　　采集了湖北省黃岡、黃石、荊州、隨州、天門、武漢、襄陽、咸寧8個地區(qū)23個雞場的新鮮糞便，球蟲卵囊鏡檢結(jié)果顯示有20個樣本檢出球蟲卵囊，感染率為

4、87.0％。檢出的卵囊孢子化后在雞體內(nèi)進行擴大增殖，根據(jù)柔嫩艾美耳球蟲寄生位置的特異性，收集盲腸中的柔嫩艾美耳球蟲卵囊。雞體增殖實驗得到20個柔嫩艾美耳球蟲野外分離株。
　　(2)相關(guān)抗藥基因的擴增及測序
　　通過PCR和RT-PCR，擴增得到MIC2，SAG,cation-transporting ATPase和Cytb基因，序列測定結(jié)果表明:MIC2基因無堿基突變;SAG基因蟲株之間無突變，但與Genebank報道的序列

5、存在一個堿基差異，此突變?yōu)橥x突變;根據(jù)堆型艾美耳球蟲陽離子轉(zhuǎn)運ATPase基因保守序列設計相關(guān)PCR引物，在柔嫩艾美耳球蟲中擴增得到約500bp產(chǎn)物，測序并進行同源性比對。同源性比對發(fā)現(xiàn)此段序列與其他艾美耳球蟲有很高的相似性，表明擴增得到的此段序列為柔嫩艾美耳球蟲陽離子轉(zhuǎn)運ATPase基因的一部分，序列比對表明此段序列在不同分離蟲株間無突變;Cytb基因測序發(fā)現(xiàn)第22位點，第49位點和第838位點存在差異，且均為錯義突變，分別導致Cy

6、tb氨基酸序列第8位點(Qisite)、第17位點和第280位點的氨基酸變異。
　　(3)不同E.tenella分離株對三種抗球蟲藥的敏感程度
　　根據(jù)基因型和地理分布，把20個蟲株分為9類，通過籠養(yǎng)實驗檢測對馬杜拉霉素、地克珠利和癸氧喹啉的敏感程度。結(jié)果表明野外分離蟲株對馬杜拉霉素都表現(xiàn)嚴重的抗藥性，蟲株間無明顯差異;野外分離蟲株對地克珠利敏感，蟲株間差異不大;癸氧喹啉的抗藥性則表現(xiàn)明顯的蟲株地區(qū)差異與基因型的差異:湖北東

7、部蟲株敏感，其他地方蟲株抗藥;未突變株敏感，突變株則表現(xiàn)明顯的抗藥性。
　　(4)相關(guān)抗藥性基因的突變與抗藥性產(chǎn)生的關(guān)系
　　通過分析MIC2、SAG、cation-transporting ATPase和Cytb基因的序列與相關(guān)抗藥性的關(guān)系，得出結(jié)論:本研究中無法證實球蟲對地克珠利抗藥性產(chǎn)生機制與MIC2&SAG的基因突變有關(guān);球蟲對馬杜拉霉素的抗藥性與ATPase基因的突變無關(guān);Cytb第22位堿基的突變可能是導致球蟲癸