StOSM基因及其耐旱功能研究.pdf

1、干旱脅迫已成為世界性問題，其對作物的危害超過其他逆境危害的總和，因此研究植物耐旱分子機(jī)制成為植物基因工程研究的重點(diǎn)。滲調(diào)蛋白(Osmotin)是植物細(xì)胞膜的組成蛋白，有研究表明OSM在植物對低溫和真菌脅迫產(chǎn)生響應(yīng)，但其對干旱脅迫、尤其是不同OSM同工型對缺水是否產(chǎn)生響應(yīng)，如何響應(yīng)等問題知之甚少。
　　本實(shí)驗(yàn)室從馬鈴薯缺水脅迫消減cDNA文庫中，獲得了的缺水脅迫響應(yīng)OSM基因EST，經(jīng)BLAST檢索發(fā)現(xiàn)其與膜組成蛋白StOSM-3B

2、99％相似，檢索也識(shí)別了馬鈴薯基因組中至少存在11個(gè)StOSM基因;本研究明確了11個(gè)StOSM編碼基因12個(gè)染色體上的分布、保守區(qū)域以及氨基酸序列的進(jìn)化關(guān)系。
　　StOSM基因表達(dá)定性測定顯示，隨缺水脅迫加重，StOSM-3F、8E和5A等8個(gè)基因mRNA表達(dá)量明顯增加，其余3個(gè)下調(diào)表達(dá);表達(dá)定量測定表明，在干旱致死零界點(diǎn)(DLP)8個(gè)上調(diào)表達(dá)基因在幼葉的表達(dá)量平均高于對照4倍，其中，StOSM-8E mRNA積累量高于對照4

3、9倍，該結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序計(jì)算的RPKM表達(dá)量結(jié)果一致。
　　研究分離獲得了StOSM-3B的全長cDNA，其中ORF為744bp，推測其編碼247個(gè)氨基酸組成的滲調(diào)蛋白，其與GenBank中記載的StOSM-3B推測的氨基酸存在6處突變;用分離獲得的cDNA構(gòu)建了OSM-3b原核表達(dá)載體pET-28c-OSM，將其轉(zhuǎn)化到宿主菌大腸埃希氏菌BL21(DE3)中，獲得了重組菌株BL21-OSM。
　　在PEG6000濃度梯度滲透

4、脅迫下，重組菌BL21-OSM的菌落存活數(shù)統(tǒng)計(jì)顯示，各濃度下對照菌BL21菌落存活數(shù)顯著低于重組菌BL21-OSM;2％ PEG6000下重組菌的峰值存活數(shù)是對照的3倍;在NaCl濃度梯度滲透脅迫下，BL21-OSM菌落存活數(shù)顯著高于對照菌，1％ NaCl下重組菌峰值存活數(shù)是對照的2倍。
　　構(gòu)建了StOSM抑制和過量表達(dá)載體(pCAMBIA1305-OSM-、pCAMBIA1305-OSM)，轉(zhuǎn)化StOSM植物體內(nèi)表達(dá)，陽性轉(zhuǎn)化

5、株系StOSM mRNA表達(dá)檢測和表型觀察顯示， StOSM抑制轉(zhuǎn)化株系幼苗缺水脅迫壽命明顯短于對照，缺水脅迫下StOSM過量轉(zhuǎn)化株系葉片較對照小，但其生長狀態(tài)明顯較對照健康。
　　體內(nèi)外表達(dá)分析結(jié)果表明，缺水誘導(dǎo)膜組成蛋白編碼基因StOSM上調(diào)表達(dá)，響應(yīng)缺水脅迫;增強(qiáng)StOSM表達(dá)可顯著增強(qiáng)植物耐旱性。
　　分離獲得的KT啟動(dòng)子的全長DNA序列比對發(fā)現(xiàn)，其與GenBank中的耐鹽基因（HG975450，Solanum pe