轉(zhuǎn)基因聚合提高煙草耐旱性的研究.pdf

1、目前，水資源短缺是公認(rèn)的全球性環(huán)境問題之一。干旱對(duì)世界作物產(chǎn)量的影響，在諸自然逆境中占據(jù)首位，其危害相當(dāng)于其他自然災(zāi)害之和。已報(bào)道的提高植物對(duì)非生物逆境抗性的基因工程大多數(shù)是通過將單個(gè)目的基因轉(zhuǎn)入植物，獲得的轉(zhuǎn)基因植物抗逆性提高水平仍有待提高。由于植物的耐旱性是受多基因控制的復(fù)雜遺傳性狀，依賴于多個(gè)基因之間的相互作用，因此，轉(zhuǎn)入單個(gè)耐旱相關(guān)基因只能部分提高植物的耐旱性。一般認(rèn)為，將多個(gè)耐旱相關(guān)基因聚合到同一植物中有可能會(huì)大大提高轉(zhuǎn)基因植

2、物抵抗干旱脅迫的能力。 來源于大腸桿菌的betA基因，編碼膽堿脫氫酶，轉(zhuǎn)入植物后可提高細(xì)胞甘氨酸甜菜堿含量；來自于鹽芥的TsVP基因編碼V-H+-PPase，該基因過表達(dá)可提高液泡膜逆濃度梯度轉(zhuǎn)運(yùn)離子的能力。已有的基因工程研究表明，分別過量表達(dá)這兩個(gè)基因都可以明顯改善植物的耐旱性。 本工作以分別轉(zhuǎn)betA基因煙草（BL）、轉(zhuǎn)TsVP基因煙草（TL）和通過有性雜交方法獲得聚合有betA基因和TsVP基因betA×TsVP（

3、BT）煙草為材料，RT-PCR結(jié)果和甘氨酸甜菜堿含量檢測(cè)以及V-H+-PPase水解活性的測(cè)定結(jié)果都表明，兩個(gè)轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定存在于轉(zhuǎn)基因聚合的煙草植株中，并活躍表達(dá)。對(duì)轉(zhuǎn)單基因植株和轉(zhuǎn)基因聚合植株在植株和細(xì)胞水平上進(jìn)行了耐旱性分析，主要結(jié)果如下： 在加有甘露醇的培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)基因聚合株系（BT）表現(xiàn)出比轉(zhuǎn)單基因株系和未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩晗递^高的種子萌發(fā)率，表明轉(zhuǎn)基因聚合相比轉(zhuǎn)單基因提高了煙草在種子萌發(fā)階段的耐旱性。 四葉期的煙草小苗

4、進(jìn)行持續(xù)干旱脅迫，在未轉(zhuǎn)基因WT植株大部分已經(jīng)枯萎死亡時(shí)，轉(zhuǎn)單基因株系和轉(zhuǎn)基因聚合株系植株大部分仍然存活，且轉(zhuǎn)基因聚合株系的存活率和存活植株的鮮重最高，但未達(dá)到差異顯著。 干旱脅迫處理后，轉(zhuǎn)TsVP基因植株和轉(zhuǎn)基因聚合植株比WT植株和轉(zhuǎn)betA基因植株生長(zhǎng)快，具有旺盛的地上部分和發(fā)達(dá)的根系，其中轉(zhuǎn)基因聚合植株的生物量最高。在正常生長(zhǎng)條件下，轉(zhuǎn)TsVP基因植株和轉(zhuǎn)基因聚合植株的凈光合速率顯著高于WT和轉(zhuǎn)betA基因植株的，而TsV

5、P轉(zhuǎn)基因植株和轉(zhuǎn)基因聚合植株之間以及WT和轉(zhuǎn)betA基因植株之間在光合能力上沒有顯著差異。干旱脅迫處理導(dǎo)致所有株系植株的光合活性下降，但轉(zhuǎn)基因植株的凈光合速率和Fv/Fm都比WT植株的高，表明轉(zhuǎn)基因植株在干旱脅迫下仍保持較高的光合效率。其它光合作用參數(shù)的測(cè)定結(jié)果也表明轉(zhuǎn)基因植株在干旱脅迫條件下比WT植株具有更好的光合能力，但轉(zhuǎn)基因聚合植株與轉(zhuǎn)單基因植株相比差異不顯著。 干旱脅迫前后，轉(zhuǎn)TsVP基因植株和轉(zhuǎn)基因聚合植株的可溶性總糖

6、的含量比WT和轉(zhuǎn)betA基因植株要高，且轉(zhuǎn)基因聚合的植株最高。在干旱脅迫之后，轉(zhuǎn)基因聚合植株和轉(zhuǎn)單基因植株比WT植株脯氨酸含量高，各轉(zhuǎn)基因植株之間差異不顯著。轉(zhuǎn)基因聚合株系中較高的糖和脯氨酸含量以及低的滲透勢(shì)有利于煙草植株在干旱脅迫下水分吸收和葉片的水分保持。 干旱使膜系統(tǒng)受到傷害，導(dǎo)致不同株系植株的葉片MDA含量和細(xì)胞電解質(zhì)外滲率大幅度升高。WT植株的MDA含量和細(xì)胞電解質(zhì)外滲值最大，而轉(zhuǎn)基因聚合植株的最小，表明WT植株細(xì)胞受

7、到的傷害最重，而轉(zhuǎn)基因聚合細(xì)胞受害程度最小。在細(xì)胞學(xué)水平上對(duì)滲透脅迫下細(xì)胞活力和線粒體膜完整性的測(cè)定結(jié)果得出同樣的結(jié)論，即在相同的脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因聚合株系受害程度低，原生質(zhì)體活力高和線粒體膜完整性好。 利用pH敏感的熒光探針BCECF-AM結(jié)合激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)檢測(cè)了滲透脅迫對(duì)葉肉細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)和液泡pH值的影響。在10％PEG處理下，無論是細(xì)胞質(zhì)還是液泡，轉(zhuǎn)TsVP基因和轉(zhuǎn)基因聚合植株的細(xì)胞，pH變化幅度較小。根據(jù)能斯特方