草魚IL-8基因在炎癥反應(yīng)中的功能研究.pdf

1、目的：白細(xì)胞介素8(interleukin-8, IL-8)是一種CXC趨化因子,可激活和趨化嗜中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞等,在炎癥、腫瘤等多種疾病中具有重要作用。草魚是我國主要的淡水養(yǎng)殖品種之一,但其易受病原微生物感染,發(fā)生炎癥乃至死亡。本研究在已克隆到草魚IL-8基因的基礎(chǔ)上,對草魚IL-8重組蛋白(rgcIL-8)的功能進(jìn)行鑒定。利用制備的抗草魚IL-8多克隆抗體,檢測了草魚生理及病理?xiàng)l件下體內(nèi)各免疫相關(guān)組織中IL-8蛋白

2、分泌量的變化,旨在探討魚類IL-8在草魚炎癥反應(yīng)中的功能。
　　方法：首先應(yīng)用Ni-NTA親和層析技術(shù)純化原核表達(dá)的rgcIL-8,并通過Transwell趨化實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)刺激實(shí)驗(yàn)研究rgcIL-8的生物學(xué)功能;其次,以純化的rgcIL-8為免疫原,制備抗草魚IL-8多克隆抗體,應(yīng)用Western blot方法驗(yàn)證特異性、間接ELISA測定效價(jià),并采用棋盤滴定法,確定抗原抗體的最佳工作濃度,建立可檢測草魚體內(nèi)IL-8蛋白的間接ELI

3、SA方法;最后,利用制備的多克隆抗體,運(yùn)用熒光免疫技術(shù)分析正常草魚及LPS刺激后草魚各免疫相關(guān)組織中天然IL-8蛋白的分泌及分布。
　　結(jié)果：Transwell趨化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,rgcIL-8對草魚頭腎中性粒細(xì)胞具有明顯的趨化活性,且這種趨化作用呈濃度依賴性;體內(nèi)刺激實(shí)驗(yàn)顯示,rgcIL-8可引起受刺激部位局部發(fā)生白細(xì)胞的聚集,出現(xiàn)急性炎癥反應(yīng)類似的組織病理變化。多克隆抗體檢測結(jié)果表明,實(shí)驗(yàn)所得多克隆抗體可特異性識別IL-8蛋白(

4、rgcIL-8),效價(jià)可達(dá)1:40000,并建立了可檢測草魚體內(nèi)天然IL-8蛋白的間接ELISA方法。草魚各免疫相關(guān)組織中g(shù)cIL-8表達(dá)情況的研究結(jié)果顯示,gcIL-8在各免疫相關(guān)組織呈組成型表達(dá)。LPS誘導(dǎo)后,各免疫相關(guān)組織gcIL-8含量均顯著升高。其中,體腎、肝臟及腸道于刺激4 h,IL-8蛋白表達(dá)量迅速升高至最高值,頭腎、鰓和脾臟等組織中IL-8蛋白含量于刺激后12 h才達(dá)到最高值,胸腺則在刺激4 h、12 h時(shí)沒有明顯變化,

5、24 h略有升高,顯示gcIL-8在草魚免疫調(diào)節(jié)中的重要作用。
　　結(jié)論：本研究驗(yàn)證了草魚IL-8在細(xì)胞水平上的趨化活性以及機(jī)體水平上的致炎功能,成功制備了特異性較好、效價(jià)較高的IL-8多克隆抗體,建立了可以檢測草魚體內(nèi)IL-8的間接ELISA方法;并首次探討了生理及病理狀況下草魚IL-8在各免疫相關(guān)組織中的分泌及分布情況,初步明確了IL-8在草魚炎癥反應(yīng)中的功能,為進(jìn)一步研究魚類IL-8作用機(jī)制、開發(fā)魚類抑炎靶向性藥物提供基礎(chǔ)。