淇河鯽IL-8的基因克隆與表達(dá)研究及其多克隆抗體的制備.pdf

1、白細(xì)胞介素-8(IL-8)是一種CXC型趨化因子，它與魚(yú)類的先天性免疫關(guān)系密切。本研究采用同源克隆和RACE技術(shù)克隆了淇河鯽(Carassius auratus in Qihe river)IL-8的cDNA全序列，并通過(guò)構(gòu)建pET-32a(+)重組載體制備了具有免疫原性的IL-8蛋白，然后免疫動(dòng)物獲得了兔抗淇河鯽IL-8多克隆抗體。另外，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)IL-8基因在健康淇河鯽不同組織的表達(dá)規(guī)律，并經(jīng)腹腔注射LPS后0

2、h、4h、8h、12h、1d、3d、7d，檢測(cè)肌肉、脾臟、頭腎、腸4個(gè)組織中IL-8基因的相對(duì)表達(dá)量。
　　1.淇河鯽IL-8的基因克隆及序列分析
　　淇河鯽IL-8cDNA序列全長(zhǎng)為641bp，其中5'非編碼區(qū)102bp、3'非編碼區(qū)242bp和開(kāi)放閱讀框297bp，共編碼98個(gè)氨基酸。肽鏈結(jié)構(gòu)中含有4個(gè)保守的半胱氨酸，前兩個(gè)半胱氨酸之間被一個(gè)精氨酸隔開(kāi);第一個(gè)半胱氨酸前缺乏經(jīng)典的ELR（谷氨酸-亮氨酸-精氨酸）結(jié)構(gòu);預(yù)測(cè)

3、的空間結(jié)構(gòu)含1個(gè)α螺旋和3個(gè)β折疊;淇河鯽IL-8與鯉魚(yú)、鳙魚(yú)、草魚(yú)、鰱魚(yú)等鯉科魚(yú)類的氨基酸同源性較高。
　　2.淇河鯽IL-8基因的組成型和誘導(dǎo)性表達(dá)
　　定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，淇河鯽IL-8基因在頭腎、肌肉、脾臟、肝胰臟、腸、鰓、心臟、腦8個(gè)組織都有表達(dá)，肌肉中表達(dá)量最高，其次為脾臟、頭腎和腦等。
　　腹腔注射LPS對(duì)肌肉、脾臟、頭腎和腸道IL-8表達(dá)均有上調(diào)作用。肌肉IL-8表達(dá)量在注射后3d達(dá)到最高;脾臟IL-8

4、表達(dá)量在4h時(shí)即達(dá)到較高水平，之后趨于穩(wěn)定;腎IL-8在注射后4h即達(dá)到最大值，之后逐漸下降，3d后表達(dá)量趨于穩(wěn)定;腸IL-8表達(dá)量隨時(shí)間點(diǎn)呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，12h達(dá)到最大值。生理鹽水也可上調(diào)被檢的4種組織IL-8的表達(dá)。
　　3.淇河鯽IL-8的原核表達(dá)及多克隆抗體的制備
　　選取淇河鯽IL-8不含信號(hào)肽的編碼序列，引入EcoRⅠ和HindⅢ限制性酶切位點(diǎn)，構(gòu)建了pET-32a(+)-IL-8重組表達(dá)載體，在大腸桿菌Ro