OsSPX3和OsSPX5調(diào)控水稻磷信號與磷平衡的功能研究.pdf

1、酵母含SPX結(jié)構(gòu)域基因參與磷信號調(diào)控與細(xì)胞磷平衡。植物中含SPX結(jié)構(gòu)域的基因參與調(diào)控磷信號與體內(nèi)磷平衡也有報(bào)道。研究水稻中SPX結(jié)構(gòu)域基因的功能，有助我們深入了解植物中磷信號的調(diào)控途徑。根據(jù)數(shù)據(jù)庫中已知信息，本研究從水稻中克隆了OsSPX5(SPXS)的全長cDNA，并對OsSPX3(SPX3)與SPX5功能進(jìn)行研究。
　　 水稻SPXs亞家族包含六個(gè)基因(SPX1-6)，與擬南芥等物種的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，SPX1和SPX2為

2、CladeⅠ組，SPX4為CladeⅢ組，SPX3、SPX5和SPX6是CladeⅡ組。擬南芥中CladeⅡ組有一個(gè)基因而水稻等禾本科植物中進(jìn)化出了三個(gè)種內(nèi)同源基因PX3、SPX5與SPX6。
　　 在不同營養(yǎng)元素缺失條件處理下，qRT-PCR分析表明SPX3和SPX5受缺磷特異誘導(dǎo)。在phr2突變體中SPX3和SPX5缺磷誘導(dǎo)被抑制，表明SPX3和SPX5的缺磷誘導(dǎo)受磷信號中心調(diào)控因子PHR2調(diào)控。利用自身啟動子與基因融合GF

3、P(SPX3p-SPX3-GFP和SPX5p-SPX5-GFP)的轉(zhuǎn)基因植株，進(jìn)行Western印跡分析，發(fā)現(xiàn)缺磷時(shí)SPX3和SPX5蛋白水平是積累的。
　　 亞細(xì)胞定位分析表明SPX3和SPX5在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中都有表達(dá)，預(yù)示著兩基因可能在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中都有功能。利用原位雜交和兩基因融合GUS(β-glu curoni dase)報(bào)告基因(SPX3p-SPX3-GUS和SPX5p-SPX5-GUS)轉(zhuǎn)基因植株，證明兩基因轉(zhuǎn)錄

4、和蛋白水平在缺磷下都積累，且表達(dá)模式相似，暗示了兩基因可能有相同的功能。
　　 在正常供磷和低磷條件下SPX3和SPX5的超表材料植株受抑制，地上部有效磷減少和根有效磷的積累，磷饑餓響應(yīng)基因(PSI gene)的表達(dá)受到顯著抑制。超表達(dá)材料葉中磷下降但磷信號基因表達(dá)下降，表明SPX3和SPX5負(fù)調(diào)控植物磷信號基因表達(dá)。我們獲得了SPX3 T-DNA插入突變體(ALNE05)，并且發(fā)展了SPX5 RNAi干涉材料，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)抑制一個(gè)

5、基因的表達(dá)其植株在表型和磷濃度與野生型沒有顯著差異。進(jìn)一步研究表明兩基因抑制植株(spx3/SPX5-Ri3)生長受抑制，葉片磷濃度顯著積累，說明兩基因功能冗余。對spx3/SPX5-Ri3植株缺磷10天然后恢復(fù)供磷的實(shí)驗(yàn)表明，該材料供磷后磷饑餓信號表達(dá)水平回復(fù)到正常水平遲緩，體內(nèi)磷上升速度激增。我們認(rèn)為，SPX3和SPX5可以調(diào)控根向地上部磷的轉(zhuǎn)運(yùn)，并且兩基因?qū)χ参镞m應(yīng)外界磷濃度變化，維持植物體內(nèi)磷濃度相對穩(wěn)定發(fā)揮重要作用。
　

6、　 酵母雙雜(yeast two-hybrid，YTH)、蛋白免疫共沉淀(co-immunoprecipitation，co-IP)和雙分子熒光互補(bǔ)(bimolecular fluorescence complementation，BiFC)實(shí)驗(yàn)表明，SPX3和SPX5可以形成同源二聚體也可以形成異源二聚體。根據(jù)SPX3和SPX5功能冗余的結(jié)果，其同源二聚體或異源二聚體都可能單獨(dú)發(fā)揮功能。
　　 由于SPX3和SPX5超表達(dá)抑

7、制了水稻磷信號中心調(diào)控因子PHR2調(diào)控的PSI基因表達(dá)。我們發(fā)展了SPX3和SPX5分別與PHR2雙超表達(dá)的遺傳材料(PHR2-Ov/SPX3-Ov1;HR2-Ov/SPX5-Ov1)，在雙超表達(dá)材料中，由PHR2-Ov造成的地上部磷積累與PSI基因上調(diào)表達(dá)被抑制達(dá)到接近野生型水平。表明SPX3與SPX5是PHR2功能的負(fù)調(diào)控因子。pho2突變體地上部磷積累，為確定SPX3與SPX5是否參與PHO2下游基因的調(diào)控，我們發(fā)展了pho2/S

8、PX3-Ov1和pho2/SPX5-Ov1遺傳材料。磷分析表明，SPX3和SPX5超表達(dá)只部分降低pho2突變體地上部磷濃度。因PHR2可直接調(diào)控一些磷轉(zhuǎn)運(yùn)體，如PT2，在pho2突變體中超表達(dá)SPX3和SPX5產(chǎn)生地上部磷濃度部分下降，可能是由SPX3和SPX5通過抑制PHR2引起。體外與體內(nèi)蛋白互作分析表明，SPX3及SPX5與PHR2蛋白物理互作，支持上述推斷。
　　 以上研究結(jié)果表明，SPX3和SPX5兩個(gè)種內(nèi)同源基因功