作物缺磷和菌根信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中調(diào)控基因的鑒定與功能驗(yàn)證.pdf

1、磷(Phosphorus，P)是植物生長發(fā)育必需的大量營養(yǎng)元素之一，廣泛地參與到植物體內(nèi)的能量轉(zhuǎn)移、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、光合作用等過程。它還是許多生物大分子如核酸、磷脂和含磷蛋白酶類的重要組成部分。然而，由于P在土壤中容易被固定和沉淀，且植物從土壤中吸收的主要是無機(jī)態(tài)正磷酸鹽(Phosphate，Pi)，故相對(duì)于其他營養(yǎng)元素，P在土壤中的移動(dòng)性和有效性均很低，其也因此常常成為農(nóng)田及自然生態(tài)系統(tǒng)中植物生長的主要限制因子之一。植物在漫長的進(jìn)化過程中發(fā)

2、展出了一套適應(yīng)缺磷環(huán)境的形態(tài)變化及生理生化方面的機(jī)制，包括根系構(gòu)型的改變、酸性磷酸酶、RNA酶及有機(jī)酸的分泌、與叢枝菌根真菌(AMF，(A)rbuscular(M)ycorrhizal(F)ungi)形成共生體系等等。
　　 植物對(duì)缺磷環(huán)境的這些適應(yīng)性機(jī)制都是由其背后一系列精巧的分子機(jī)制作為支撐的。近年來，該研究領(lǐng)域科學(xué)家們針對(duì)這些分子機(jī)制做了大量的研究，初步構(gòu)建了植物缺磷和菌根共生信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。這個(gè)網(wǎng)絡(luò)中的“節(jié)點(diǎn)

3、”，即基因之間在不同水平存在著復(fù)雜的調(diào)控或被調(diào)控的關(guān)系。一個(gè)基因在表達(dá)豐度或時(shí)間空間上的變化可能會(huì)造成整個(gè)網(wǎng)絡(luò)的重新調(diào)整。雖然我們對(duì)植物缺磷和菌根共生信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑這兩個(gè)分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識(shí)正不斷深入，發(fā)現(xiàn)了在前者中起中心調(diào)控作用并可能連接兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵調(diào)控因子PHR((PH)osphate Starvation(R)esponse)，但根據(jù)近年來該領(lǐng)域的研究進(jìn)展來看，欲全面揭開其神秘的面紗仍有諸多工作要做。為了對(duì)這兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行進(jìn)一步的補(bǔ)充

4、完善，本研究以鑒定植物中參與到缺磷和菌根共生信號(hào)途徑中的微小RNA(microRNA，miRNA)和轉(zhuǎn)錄因子基因兩方面作為切入點(diǎn)，取得了以下的主要結(jié)果:
　　 1.根據(jù)已知植物中所有miRNA的成熟片段序列，與茄科植物煙草的GSS(Genome Survey Sequence)和EST(Expressed Sequence Tag)序列進(jìn)行比對(duì)，繼而由生物信息學(xué)技術(shù)從煙草中預(yù)測(cè)到分屬于84個(gè)家族共計(jì)276個(gè)miRNA基因，并分析

5、了全部276個(gè)基因的一系列特征參數(shù)。發(fā)現(xiàn)煙草miRNA也是以多基因家族的方式出現(xiàn);其成熟片段和前體結(jié)構(gòu)的長度分別集中在21個(gè)堿基和75-114個(gè)堿基左右;90％以上miRNA前體的A和U含量之和在50％-70％之間;在不同物種中非常保守的缺磷誘導(dǎo)表達(dá)的miR399和miR827在缺磷條件下的煙草中表達(dá)也發(fā)生上調(diào)。
　　 2.通過miRNA基因芯片結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的方法在茄科植物番茄中鑒定出23個(gè)保守的miRNA，發(fā)現(xiàn)其中16個(gè)受到磷

6、素營養(yǎng)或菌根共生信號(hào)或二者共同的調(diào)控。證明了miRNA基因表達(dá)的變化也是植物缺磷和菌根共生信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中重要的組成部分，且植物缺磷和菌根共生信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑存在部分重疊。
　　 3.采用RT-PCR方法結(jié)合生物信息學(xué)及組織化學(xué)分析研究了水稻中缺磷誘導(dǎo)表達(dá)的miRNA基因，osa-miR827a(OsmiR827a)及其靶基因。發(fā)現(xiàn)OsmiR827a受缺磷信號(hào)專一性誘導(dǎo)表達(dá)，且其成熟片段可能作為長距離運(yùn)輸信號(hào)分子通過韌皮部從地上部轉(zhuǎn)運(yùn)

7、到地下部。此外，結(jié)果表明雖然miRNA827在不同物種中非常保守，但其對(duì)靶基因的調(diào)控機(jī)制可能在單子葉和雙子葉植物物種分化的過程中發(fā)生了變異。不同于擬南芥AtmiR827的靶基因AtNLA((N)itrogen(L)imitation(A)daptation;屬于SPX家族中的SPX-RING亞家族），水稻OsmiR827a的靶基因?qū)儆赟PX家族中的SPX-MFS-1亞家族，且其靶基因有兩個(gè)，OsSPX7和OsSPX8。雖然二者的氨基酸序

8、列一致性大于80％、結(jié)構(gòu)高度相似且都定位于細(xì)胞質(zhì)膜上，但對(duì)缺磷信號(hào)的響應(yīng)卻完全相反。
　　 4.對(duì)OsSXP7和OsSPX8兩個(gè)基因各兩個(gè)株系的Tosl7轉(zhuǎn)座子插入突變體(osspx7-1、osspx7-2和osspx8-1、osspx8-2)在不同供磷條件下的表型、有效磷含量等生理指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定后發(fā)現(xiàn)，osspx7-2在高磷和全銨營養(yǎng)且高磷處理下表現(xiàn)出磷中毒的癥狀，其葉片中有效磷濃度在兩種處理下分別為野生型植株的6.2倍和3.8

9、倍，在低磷條件下其葉片中有效磷濃度與野生型植株相比提高了1倍;對(duì)于OsSPX8兩個(gè)株系的突變體osspx8-1和osspx8-2，只有在高磷和全銨營養(yǎng)且高磷兩種條件下，其葉片中的有效磷含量比野生型植株提高40％左右。此外，通過對(duì)突變體中磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(PT，Phosphate Transporter)基因及其它缺磷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中基因表達(dá)的檢測(cè)及與其它在正常供磷條件下表現(xiàn)出磷中毒癥狀的突變體或轉(zhuǎn)基因植株的情況相比較，我們推測(cè)OsSXP7和

10、OsSPX8至少部分是通過抑制PT基因表達(dá)來實(shí)現(xiàn)其在植物體內(nèi)磷的動(dòng)態(tài)平衡過程中的作用。
　　 5.在水稻缺磷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中心調(diào)控因子基因OsPHR2（(PH)osphate Starvation(R)esponse(2))的過量表達(dá)植株中對(duì)OsmiR827a的表達(dá)豐度進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明OsmiR827a可能是新發(fā)現(xiàn)的由OsPHR2直接調(diào)控的下游基因。
　　 6.通過將番茄中菌根特異表達(dá)PT基因LePT4的啟動(dòng)子進(jìn)行分割

11、和定點(diǎn)突變、融合GUS報(bào)告基因繼而由根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法轉(zhuǎn)入煙草中檢測(cè)分析，證明了缺磷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵順式調(diào)控元件P1BS((P)HR1 Binding Sequence)對(duì)茄科植物中菌根誘導(dǎo)或特異表達(dá)的PT基因的轉(zhuǎn)錄激活是必不可少的。而此轉(zhuǎn)錄激活過程不需要調(diào)控豆科植物血紅蛋白基因在根瘤和菌根組織特異性表達(dá)相關(guān)的NODCON2GM和參與植物的防御反應(yīng)的WRKY710S這兩個(gè)順式調(diào)控元件的參與。
　　 7.根據(jù)擬南芥和水

12、稻中PHR基因的保守序列設(shè)計(jì)簡并引物，以煙草cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測(cè)序獲得其保守區(qū)序列后通過RLM-RACE方法獲得了煙草PHR同源基因NtPHR2的cDNA全長序列。氨基酸序列比對(duì)和進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，NtPHR2與擬南芥AtPHR1和水稻OsPHR2一樣屬于MYB轉(zhuǎn)錄因子家族中的MYB-CC(Coiled-Coil)亞家族，且與AtPHR1的親緣關(guān)系最近。
　　 8.通過基因槍轟擊洋蔥表皮、RT-PCR和酵母雙雜交系