水稻高親和磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因OsPhtl;8的功能研究.pdf

1、磷(P)是植物生長(zhǎng)發(fā)育最為重要的生命元素之一，廣泛參與植物體內(nèi)的生化合成、能量轉(zhuǎn)移、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等代謝過(guò)程。由于化學(xué)和微生物的強(qiáng)烈固定，大多數(shù)自然土壤中的有效磷很低，限制著植物的生長(zhǎng)發(fā)育。植物為了適應(yīng)低磷脅迫已經(jīng)進(jìn)化出了包括改變根系形態(tài)結(jié)構(gòu)、與土壤中的菌根(Mycorrhiza)真菌形成共生體系、改善根際土壤化學(xué)性質(zhì)、誘導(dǎo)高親和磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(PT)的表達(dá)等形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理生化上的響應(yīng)機(jī)制。其中植物通過(guò)在根系細(xì)胞膜上表達(dá)多種不同親和力的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白

2、來(lái)吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)土壤中的有效磷。迄今為止，大多數(shù)被分離和鑒定的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白都屬于高親和的Pht1家族。水稻Pht1家族中共有13個(gè)成員，但它們中間只有部分基因的功能得到了闡明。由于水稻是我國(guó)最重要的糧食作物和模式作物，因此開(kāi)展水稻高親和磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因功能研究，對(duì)揭示植物高效調(diào)控吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)磷營(yíng)養(yǎng)的機(jī)理具有重要意義。
　　 本試驗(yàn)以水稻磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Pht1家族基因成員之一OsPht1;8（以下簡(jiǎn)稱(chēng)OsPT8）為研究對(duì)象，以粳稻品種日本晴和D

3、ongjing為試驗(yàn)材料，通過(guò)RT-PCR、Q-PCR、酵母和蛙卵異源表達(dá)體系以及水稻轉(zhuǎn)基因技術(shù)，研究了OsPT8的表達(dá)特征和功能，所獲得的主要結(jié)果如下:
　　 1.通過(guò)生物信息學(xué)分析表明整個(gè)水稻Pht1家族基因同源性很高，OsPT8位于水稻基因組10號(hào)染體上，沒(méi)有內(nèi)含子，在水稻基因組中以單拷貝形式存在。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示OsPT8是一個(gè)質(zhì)膜蛋白。
　　 2.通過(guò)對(duì)OsPT8基因表達(dá)模式分析和異源系統(tǒng)中的功能研究表明:O

4、sPT8近乎組成型表達(dá)，在根、莖、葉、胚乳、種殼和花藥等部位都有強(qiáng)烈表達(dá)，但在根部和地上部仍然受低磷誘導(dǎo)，表達(dá)增強(qiáng)。OsPT8所編碼的蛋白能夠與缺失磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PHO84的酵母突變體實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)，酵母中的pH生長(zhǎng)試驗(yàn)表明OsPT8所編碼的蛋白是一個(gè)與質(zhì)子相偶聯(lián)的磷運(yùn)輸?shù)鞍祝?3p吸收試驗(yàn)計(jì)算得出OsPT8在酵母中的Km=21μM;蛙卵異源表達(dá)試驗(yàn)也表明其具有吸收外源磷酸鹽的功能，33p吸收試驗(yàn)計(jì)算得出OsPT8在蛙卵中的Km=27μM。兩個(gè)異

5、源系統(tǒng)結(jié)果共同顯示OsPT8是一個(gè)高親和磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。
　　 3.通過(guò)野生型及超表達(dá)和沉默OsPT8基因的轉(zhuǎn)基因水稻在高磷和低磷條件下的水培試驗(yàn)研究結(jié)果表明:在正常供磷條件下，OsPT8基因的增強(qiáng)表達(dá)增加了水稻根系對(duì)磷酸鹽的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，根部、莖、老葉、新葉中的有效磷含量達(dá)到野生型的2倍，阻礙了水稻的正常生長(zhǎng)。超表達(dá)株系表現(xiàn)出生長(zhǎng)遲緩，植株矮小，葉片發(fā)黃等典型的磷中毒癥狀;OsPT8的RNAi沉默株系顯著降低了水稻對(duì)磷酸鹽的吸收和轉(zhuǎn)

6、運(yùn)，造成根部、莖、老葉、新葉各部位有效磷含量只有野生型的70％。在低磷條件下，OsPT8超表達(dá)株系和野生型在表型上無(wú)明顯差異，同時(shí)植株內(nèi)各個(gè)部位的有效磷含量也未達(dá)到顯著性差異，但是OsPT8的RNAi沉默株系生長(zhǎng)卻顯著受阻，生物量只有野生型的60％,表明OsPT8可能是高親和磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。水培試驗(yàn)結(jié)果表明OsPT8在水稻磷酸鹽的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中起著非常重要的作用。
　　 4.通過(guò)對(duì)OsPT8基因超表達(dá)株系在不同磷肥用量的盆栽試驗(yàn)研

7、究表明，在四個(gè)磷肥用量條件下（低、偏低、中和高）超表達(dá)材料癟殼中全磷含量均達(dá)到了野生型的2-3倍，籽粒中全磷含量較野生型提高了20％;在中高磷條件下，穗柄中全磷含量分別達(dá)到野生型的2.2和3.2倍;通過(guò)檢測(cè)OsPT8基因的RNAi沉默株系和T-DNA插入突變體在正常供磷大田試驗(yàn)中穗柄、癟殼、種子和種殼中的全磷含量，發(fā)現(xiàn)OsPT8基因沉默材料中穗柄全磷含量比野生型提高了30％，而癟殼中全磷含量?jī)H有野生型的70％。盆栽和大田試驗(yàn)結(jié)果表明Os

8、PT8基因參與了磷素從營(yíng)養(yǎng)器官向生殖器官的轉(zhuǎn)運(yùn)，沉默該基因造成水稻結(jié)實(shí)率很低甚至不育。
　　 5.通過(guò)對(duì)高磷和低磷水培條件下OsPT8基因超表達(dá)材料的根系形態(tài)的研究表明，OsPT8參與了低磷脅迫對(duì)根系構(gòu)型的調(diào)控。在正常供磷條件下，根部產(chǎn)生大量的根毛，這與OsPHR2超表達(dá)后在根部的形態(tài)變化結(jié)果一致，表明OsPT8可能參與OsPHR2調(diào)控根毛生長(zhǎng)的途徑。
　　 6.通過(guò)對(duì)正常供磷條件下OsPT8超表達(dá)和敲除轉(zhuǎn)基因株系中其余

9、家族成員表達(dá)情況的分析，表明Pht1家族成員在部分功能上存在重疊。在OsPHR2超表達(dá)和RNAi沉默株系中檢測(cè)OsPT8的表達(dá)情況，結(jié)果表明OsPT8可能是OsPHR2下游的一個(gè)靶基因。
　　 總之，通過(guò)對(duì)OsPT8基因的功能進(jìn)行分析和驗(yàn)證，我們發(fā)現(xiàn)OsPT8參與了水稻整個(gè)生育期磷酸鹽的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，尤其在發(fā)育后期通過(guò)對(duì)磷酸鹽運(yùn)輸?shù)恼{(diào)控會(huì)影響水稻的灌漿。由此，OsPT8基因在響應(yīng)磷酸鹽從營(yíng)養(yǎng)器官向生殖器官轉(zhuǎn)運(yùn)的重要作用，可以為培養(yǎng)