向日葵黃萎病菌致病力分化以及GFP熒光標(biāo)記大麗輪枝孢菌的獲得.pdf

1、大麗輪枝菌（Verticillium dahliae Kleb）引起的向日葵黃萎病是一種系統(tǒng)侵染的維管束病害，是近年來我國向日葵生產(chǎn)中出現(xiàn)的主要病害之一。本研究通過對(duì)不同向日葵種植地區(qū)分離到的向日葵黃萎病菌和不同菌落培養(yǎng)型的向日葵黃萎病菌進(jìn)行致病力分化的研究，旨在為向日葵抗黃萎病育種提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。同時(shí)，本研究對(duì)PEG介導(dǎo)和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大麗輪枝菌遺傳轉(zhuǎn)化法進(jìn)行比較和優(yōu)化，建立了向日葵大麗輪枝菌的遺傳轉(zhuǎn)化體系。通過遺傳轉(zhuǎn)化獲得111個(gè)

2、帶有GFP標(biāo)簽的陽性轉(zhuǎn)化子，并對(duì)部分轉(zhuǎn)化子的菌落和孢子形態(tài)、產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)率、產(chǎn)毒能力及致病力進(jìn)行了測定。具體的研究結(jié)果如下:
　　1.通過對(duì)12株不同向日葵種植地區(qū)（采自內(nèi)蒙古自治區(qū)、寧夏回族自治區(qū)、陜西省和河北?。┓蛛x到的黃萎病菌的生物學(xué)特性和致病力進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)分離到的向日葵黃萎病菌的菌落形態(tài)存在一定的差異。12株向日葵黃萎病菌的分生孢子均為橢圓形，分生孢子梗均呈輪枝狀。12株不同地區(qū)分離到的向日葵黃萎病菌致病力測

3、定的結(jié)果表明病情指數(shù)大于30的黃萎病菌株有2株，表現(xiàn)為侵染快、發(fā)病早;病情指數(shù)大于20且小于30的黃萎病菌株有6株，表現(xiàn)為侵染較慢、發(fā)病較晚、植株死亡較少;病情指數(shù)小于20的黃萎病菌株有4株，表現(xiàn)為侵染慢、發(fā)病遲緩、一般不造成植株的死亡。這預(yù)示著不同地區(qū)分離到的向日葵黃萎病菌存在致病力分化的現(xiàn)象。
　　2.5個(gè)不同培養(yǎng)型的向日葵黃萎菌致病力分化的研究結(jié)果表明，不同培養(yǎng)型的黃萎病菌粗毒素的致萎能力存在顯著的差異，毒素含量越高的菌株，

4、其致萎能力越強(qiáng);菌株V33（能夠大量產(chǎn)生微菌核）、V21（不產(chǎn)生微菌核）、V27（產(chǎn)生一定量的微菌核及氣生菌絲）的毒素分泌量為0.36mg/mL、0.34mg/mL、0.23mg/mL，其72h致萎指數(shù)分別為58.33、52.08、37.50;采用紙缽撕底蘸根法對(duì)不同培養(yǎng)型的黃萎病菌的致病力進(jìn)行了研究，結(jié)果表明不同培養(yǎng)型黃萎病菌的致病力也存在一定的差異，黃萎病菌V33、V21和V27的病情指數(shù)分別為53.97、45.91和37.44，且

5、相互間差異顯著。黃萎病菌致病力的強(qiáng)弱與其分泌的粗毒素含量呈顯著的正相關(guān)關(guān)系(R2=0.8169，P＜0.05)，但與其菌落型以及產(chǎn)生的微菌核的數(shù)量沒有相關(guān)性。
　　3.PEG介導(dǎo)和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大麗輪枝菌遺傳轉(zhuǎn)化法比較的結(jié)果表明PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化中，制備大麗輪枝菌原生質(zhì)體的最適酶濃度為10～15mg/mL;最適酶解時(shí)間為2h;轉(zhuǎn)化效率為1～2個(gè)轉(zhuǎn)化子/μg質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化率較低且部分轉(zhuǎn)化子不能穩(wěn)定遺傳。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法對(duì)大

6、麗輪枝菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化，大麗輪枝菌轉(zhuǎn)化的最適分生孢子濃度為106個(gè)/mL;農(nóng)桿菌的OD600值范圍在0.15～0.25間轉(zhuǎn)化效率最高;用ATMT法進(jìn)行轉(zhuǎn)化的效率約為7～13個(gè)轉(zhuǎn)化子/106分生孢子。因此我們優(yōu)選農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法對(duì)大麗輪枝菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
　　4.利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法將帶有GFP熒光標(biāo)記質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大麗輪枝菌，選取19個(gè)能夠穩(wěn)定表達(dá)GFP熒光蛋白的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行表型分析，結(jié)果表明有2個(gè)轉(zhuǎn)化子的微菌核形成數(shù)量顯著的少于野生型

7、菌株;但是所有轉(zhuǎn)化子的分生孢子及分生孢子梗形態(tài)與野生型菌株沒有顯著差異;所有轉(zhuǎn)化子的產(chǎn)孢量與其孢子萌發(fā)率沒有明確的相關(guān)性;轉(zhuǎn)化子的產(chǎn)毒能力與野生型菌株有顯著差異，其中5個(gè)轉(zhuǎn)化子產(chǎn)毒能力顯著升高，12個(gè)轉(zhuǎn)化子顯著降低;轉(zhuǎn)化子的致病力和野生型相比也有顯著差異，5個(gè)轉(zhuǎn)化子的致病力顯著高于野生型菌株，9個(gè)轉(zhuǎn)化子致病力顯著低于野生型菌株;轉(zhuǎn)化子的產(chǎn)毒能力與其致病力呈正相關(guān)關(guān)系。
　　5.本研究中從向日葵黃萎病病株中分離到了尖孢鐮刀菌，通過柯