橘小實(shí)蠅rpl19 dsRNA對(duì)橘園非靶標(biāo)昆蟲(chóng)干擾效應(yīng)研究.pdf

1、RNAi是由雙鏈RNA所引起的特異性基因沉默。喂食dsRNA達(dá)到RNAi效應(yīng)在很多昆蟲(chóng)上取得成功，在害蟲(chóng)防治上表現(xiàn)出廣泛的應(yīng)用潛力，但是目前缺乏對(duì)于RNAi的安全性評(píng)價(jià)，因此評(píng)價(jià)RNAi包括對(duì)天敵和益蟲(chóng)等非靶標(biāo)昆蟲(chóng)的干擾效應(yīng)在內(nèi)的環(huán)境安全性具有非常重要的意義。
　　本研究選取橘小實(shí)蠅Bactroceradorsalis作為靶標(biāo)昆蟲(chóng)，rpl19基因作為靶標(biāo)基因，選擇近緣種柑橘大實(shí)蠅Bactroceraminax，天敵長(zhǎng)尾潛蠅繭蜂Di

2、achasmimorphalongicaudata，益蟲(chóng)意大利蜜蜂Apismellifera作為非靶標(biāo)生物，同時(shí)喂食小實(shí)蠅rpl19基因不同片段的dsRNA，利用Real-timePCR等分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)各個(gè)昆蟲(chóng)rpl19的表達(dá)情況，研究昆蟲(chóng)dsRNA對(duì)非靶標(biāo)昆蟲(chóng)的干擾效應(yīng)，為RNAi用于害蟲(chóng)防治提供安全性評(píng)價(jià)的參考依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:
　　1.成功克隆了橘小實(shí)蠅、柑橘大實(shí)蠅、長(zhǎng)尾潛蠅繭蜂和意大利蜜蜂rpl19基因cDNA全

3、長(zhǎng)。基因同源性分析結(jié)果顯示橘小實(shí)蠅rpl19基因ORF區(qū)域核酸序列與柑橘大實(shí)蠅同源性高達(dá)93％，與長(zhǎng)尾潛蠅繭蜂同源性達(dá)72％，與意大利蜜蜂有68％的同源性。用CLUSTALX2.0將橘小實(shí)蠅rpl19氨基酸序列與柑橘大實(shí)蠅、長(zhǎng)尾潛蠅繭蜂、意大利蜜蜂rpl19基因氨基酸序列同源性比對(duì)，結(jié)果顯示橘小實(shí)蠅rpl19基因氨基酸序列與柑橘大實(shí)蠅、長(zhǎng)尾潛蠅繭蜂、意大利蜜蜂同源性高達(dá)90％以上。
　　2.Real-timePCR結(jié)果表明，喂食靶

4、標(biāo)昆蟲(chóng)自身rpl19基因dsRNA可以在橘小實(shí)蠅、柑橘大實(shí)蠅、長(zhǎng)尾潛蠅繭蜂和意大利蜜蜂中均產(chǎn)生RNAi效應(yīng)，喂食Bdrpl19dsRNA后橘小實(shí)蠅rpl19基因表達(dá)分別下調(diào)50％，喂食Bmrpl19dsRNA后，柑橘大實(shí)蠅rpl19基因表達(dá)下調(diào)達(dá)90％以上，喂食Dlrpl19dsRNA后長(zhǎng)尾潛蠅繭蜂rpl19基因表達(dá)下調(diào)40％，而喂食Amrpl19dsRNA后意大利蜜蜂rpl19基因表達(dá)下調(diào)了50％。
　　3.dsRNA對(duì)非靶標(biāo)昆

5、蟲(chóng)的干擾效應(yīng)研究結(jié)果顯示喂食橘小實(shí)蠅Bdrpl19CDSdsRNA后，柑橘大實(shí)蠅rpl19基因表達(dá)水平下調(diào)了50-70％，長(zhǎng)尾潛蠅繭蜂rpl19基因表達(dá)水平下調(diào)了40％，而意大利蜜蜂rpl19基因表達(dá)量沒(méi)有變化，但喂食Bdrpl193'UTRdsRNA對(duì)三種非靶標(biāo)昆蟲(chóng)都沒(méi)有干擾效應(yīng)。而dsRNA片段核酸序列的比對(duì)結(jié)果顯示柑橘大實(shí)蠅和長(zhǎng)尾潛蠅繭蜂rpl19基因序列與橘小實(shí)蠅rpl19序列存在19-23bp完全同源的片段，而意大利蜜蜂rpl