橘小實(shí)蠅Duox-ROS系統(tǒng)和IMD信號(hào)通路功能研究.pdf

1、腸道微生物與宿主之間存在著廣泛的非致病關(guān)系，腸道共生微生物影響著宿主的生長(zhǎng)發(fā)育、能量代謝、有害物質(zhì)降解、免疫防御系統(tǒng)成熟等。如大部分后生動(dòng)物一樣，昆蟲(chóng)腸道上皮細(xì)胞無(wú)時(shí)無(wú)刻不與微生物接觸，其種類(lèi)從有益的共生菌、非共生菌、隨食物進(jìn)入的微生物到影響宿主生命的病原菌。在這樣一種復(fù)雜的環(huán)境中，為了實(shí)現(xiàn)防御腸道病原微生物的同時(shí)又能維持共生微生物穩(wěn)定的目的，宿主腸道上皮細(xì)胞必須在免疫應(yīng)激和免疫耐受之間保持一種穩(wěn)態(tài)平衡。Duox-ROS免疫系統(tǒng)和免疫缺

2、陷(Imd)信號(hào)通路作為腸道免疫反應(yīng)的基本途徑，必然參與調(diào)節(jié)此過(guò)程，然而人們對(duì)于宿主如何通過(guò)腸道免疫機(jī)制來(lái)維持其腸道微生物菌群穩(wěn)態(tài)以保持其功能的分子機(jī)理尚不清楚。本研究以橘小實(shí)蠅為研究對(duì)象，利用RNAi、qRT-PCR和Illumina MiSeq細(xì)菌16S rDNA高通量測(cè)序等分子生物學(xué)手段研究BdDuox基因在宿主腸道免疫及腸道細(xì)菌群落穩(wěn)態(tài)平衡調(diào)控中的重要作用;ROS對(duì)宿主生理功能的影響;闡述Imd信號(hào)通路在宿主免疫防御中的作用。<

3、br>　　1.Duox-ROS系統(tǒng)在腸道免疫和細(xì)菌群落穩(wěn)態(tài)調(diào)控中的作用
　　通過(guò)克隆獲取橘小實(shí)蠅雙氧化酶（BdDuox）基因編碼區(qū)核酸序列長(zhǎng)度4584bp，該基因編碼1528個(gè)氨基酸，BdDuox蛋白具有7次跨膜結(jié)構(gòu)，擁有典型的過(guò)氧化物酶結(jié)構(gòu)域。研究發(fā)現(xiàn)Duox-ROS防御系統(tǒng)在橘小實(shí)蠅腸道免疫防御中發(fā)揮著重要作用，橘小實(shí)蠅取食大腸桿菌DH5α和金黃色葡萄球菌6h和12h后，腸道BdDuox基因表達(dá)量和ROS水平顯著上調(diào);而取食腸

4、道共生菌6h后，除次要菌群蠟樣芽孢桿菌能夠顯著誘導(dǎo)BdDuox基因表達(dá)量和ROS水平顯著上升外，其余5種腸道主要菌群均不能引起B(yǎng)dDuox基因的免疫響應(yīng)，Duox-ROS免疫防御系統(tǒng)清除病原菌同時(shí)耐受腸道共生菌。
　　注射BdDuox dsRNA后的1-7天，BdDuox基因表達(dá)量下調(diào)了26-54％，腸道ROS水平下降31-44％;注射BdDuox dsRNA后的9-17天，BdDuox基因上調(diào)了1.40-1.68倍，腸道ROS水

5、平增加45-73％;而注射BdDuox dsRNA后的第20天，ds-duox干擾組BdDuox基因表達(dá)量和腸道ROS水平恢復(fù)到和ds-egfp對(duì)照組相一致水平。注射BdDuox dsRNA后的第5天和15天，橘小實(shí)蠅腸道細(xì)菌菌群密度分別增加了1.68和1.49倍，其中腸道主要菌群Enterobacteriaceae和Leuconostocaceae相對(duì)比例顯著下降，Bacillaceae、Bacteroidaceae、Verrucom

6、icrobiaceae等次要菌群相對(duì)比例顯著增加，致使腸道細(xì)菌群落穩(wěn)態(tài)紊亂;紊亂的腸道細(xì)菌群落反過(guò)來(lái)刺激宿主腸道上調(diào)表達(dá)BdDuox基因水平，介導(dǎo)大量ROS的產(chǎn)生來(lái)抑制次要菌群的過(guò)量增殖，最終在Duox-ROS系統(tǒng)調(diào)控下恢復(fù)腸道細(xì)菌群落穩(wěn)態(tài)平衡。以上結(jié)果表明BdDuox基因在橘小實(shí)蠅腸道細(xì)菌群落穩(wěn)態(tài)調(diào)控中發(fā)揮了重要作用。
　　2.ROS對(duì)橘小實(shí)蠅成蟲(chóng)生理功能的影響
　　通過(guò)RNAi技術(shù)發(fā)現(xiàn)BdCatalase基因在橘小實(shí)蠅腸

7、道氧化還原平衡維持、成蟲(chóng)生殖力和壽命中具有重要作用。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射BdCat dsRNA后的1-7天，相比于對(duì)照組，BdCat基因顯著下調(diào)了54.04-75.42％，而ds-cat干擾組腸道ROS水平上升了1.37-1.62倍;注射BdCat dsRNA后的第5天和10天，ds-cat干擾組腸道總細(xì)菌菌群密度分別下降了33.91％和34.78％。通過(guò)RNAi沉默BdDuox和BdCat基因研究ROS對(duì)宿主壽命的影響實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Bd

8、Duox和BdCat基因的沉默均不會(huì)影響宿主的平均壽命和總存活時(shí)間，但BdCat基因的沉默會(huì)延長(zhǎng)宿主的中位生存期(Median survival time)。另外，本研究發(fā)現(xiàn)BdCat基因的沉默所造成的ROS水平上升會(huì)顯著降低宿主的產(chǎn)卵量和卵孵化率，ds-cat干擾組雌蟲(chóng)在BdCat基因沉默后14-20天，單頭雌蟲(chóng)日均產(chǎn)卵量下降了31.01-57.09％，ds-cat干擾組卵孵化率下降了25.45％;而B(niǎo)dDuxo基因的沉默所導(dǎo)致的RO

9、S下降卻對(duì)宿主產(chǎn)卵量和卵孵化率無(wú)顯著影響。而通過(guò)喂食橘小實(shí)蠅化學(xué)物質(zhì)研究ROS對(duì)宿主壽命的影響實(shí)驗(yàn)中，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)橘小實(shí)蠅取食百草枯和維生素C后7天，供試蟲(chóng)體全部死亡，兩種化學(xué)物質(zhì)喂食所導(dǎo)致的ROS上升和下降大大降低了宿主壽命。
　　3.橘小實(shí)蠅IMD信號(hào)通路免疫防御功能研究
　　通過(guò)對(duì)橘小實(shí)蠅進(jìn)行條件致病菌注射和喂食感染，研究Imd信號(hào)通路在宿主系統(tǒng)和腸道免疫反應(yīng)中的作用。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)大腸桿菌DH5α注射侵染后會(huì)迅速激活I(lǐng)

10、md信號(hào)通路系統(tǒng)免疫反應(yīng)，BdDiptericin、BdRelish、BdPGRP-LB、BdPGRP-SB基因表達(dá)水平顯著上調(diào)，而B(niǎo)dPGRP-SC2基因表達(dá)量在注射后的3-12h顯著下調(diào)了55.63-90.73％。大腸桿菌DH5α短期喂食感染只能夠誘導(dǎo)腸道Duox-ROS免疫系統(tǒng)的免疫響應(yīng)，以及腸道Imd信號(hào)通路關(guān)鍵因子BdRel基因和BdPGRP-LB、BdPGRP-SB和BdPGRP-SC2基因的免疫響應(yīng)。在大腸桿菌DH5α喂食

11、感染后的3-12h， BdDuox基因表達(dá)量顯著上調(diào)了1.70-2.89倍，卻不能誘導(dǎo)Imd信號(hào)通路效應(yīng)基因BdDpt的上調(diào)表達(dá)。在對(duì)PGRPs家族基因功能的研究中，發(fā)現(xiàn)BdPGRP-LB、BdPGRP-SB和BdPGRP-SC2基因在橘小實(shí)蠅Imd信號(hào)通路中具有重要負(fù)調(diào)控作用，BdPGRP-LB、BdPGRP-SB和BdPGRP-SC2基因的沉默會(huì)導(dǎo)致Imd信號(hào)通路對(duì)大腸桿菌DH5α出現(xiàn)過(guò)激免疫響應(yīng)。
　　在大腸桿菌DH5α長(zhǎng)期

12、連續(xù)喂食感染生測(cè)實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌DH5α喂食感染的6h和12h只誘導(dǎo)Duox-ROS免疫系統(tǒng)的免疫響應(yīng)，不能激活腸道Imd信號(hào)通路的免疫反應(yīng)，與短期喂食感染結(jié)果相類(lèi)似;而在大腸桿菌DH5α喂食感染后的第3天，能夠激活腸道Imd信號(hào)通路強(qiáng)烈免疫響應(yīng)，大腸桿菌DH5α喂食后3-15天，腸道BdDpt基因上調(diào)了10.50-26.95倍;但腸道Duxo-ROS免疫系統(tǒng)在3-15天處于靜默狀態(tài)，這些結(jié)果說(shuō)明腸道Imd信號(hào)通路與Duox-ROS