脂肪酸合成與代謝通路對(duì)橘小實(shí)蠅RNAi免疫耐受及體液免疫的調(diào)控研究.pdf

1、橘小實(shí)蠅(Bactrocera dorsalis)是一種危害數(shù)百種果蔬的重要農(nóng)業(yè)害蟲，每年在中國(guó)乃至亞洲造成重大經(jīng)濟(jì)損失。RNAi是一種在真核生物中由dsRNA誘發(fā)的mRNA特異性降解的機(jī)制，由于其高效簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于基因組學(xué)，醫(yī)學(xué)以及農(nóng)業(yè)等方面的研究。雖然RNAi在真核生物中高度保守并且在農(nóng)業(yè)害蟲的研究中取得了長(zhǎng)足發(fā)展，但將其應(yīng)用于實(shí)踐生產(chǎn)還存在許多問題待解決，例如在雙翅目果蠅中喂食法不能誘導(dǎo)RNAi效應(yīng)以及在橘小實(shí)蠅中存在對(duì)R

2、NAi免疫耐受的現(xiàn)象。本研究探索了橘小實(shí)蠅對(duì)RNAi免疫耐受的分子調(diào)控機(jī)制，揭示了橘小實(shí)蠅中脂肪酸的生物合成與代謝通路在其對(duì)RNAi的免疫耐受反應(yīng)中起重要作用。并且證明了脂肪酸延伸酶對(duì)橘小實(shí)蠅的體液免疫通路也具有重要的調(diào)控作用。
　　1.已免疫橘小實(shí)蠅血淋巴能誘導(dǎo)未經(jīng)處理的橘小實(shí)蠅對(duì)RNAi的免疫耐受反應(yīng)。喂食橘小實(shí)蠅ds-rpl19，并確定成功誘導(dǎo)了RNAi免疫耐受反應(yīng)后，提取血淋巴注射并注射進(jìn)未處理的橘小實(shí)蠅中。在注射已免疫組

3、血淋巴后喂食ds-rpl19的橘小實(shí)蠅中，目的基因未出現(xiàn)下調(diào)。而注射對(duì)照組血淋巴后再喂食dsRNA的橘小實(shí)蠅中則出現(xiàn)了顯著的RNAi效應(yīng)，靶標(biāo)基因的表達(dá)量減少了51％。同時(shí)，將血淋巴在25℃下分別處理1d、2d、3d或?qū)⒀馨鸵航?jīng)-20℃低溫處理后注射，均不會(huì)影響其對(duì)RNAi免疫耐受的誘導(dǎo)能力。而經(jīng)100℃高溫處理10 min后，血淋巴液?jiǎn)适дT導(dǎo)RNAi免疫耐受反應(yīng)。注射經(jīng)高溫處理后的血淋巴液再喂食dsRNA，目的基因的表達(dá)量出現(xiàn)了48

4、％的下調(diào)。這些結(jié)果表明已對(duì)RNAi免疫耐受的橘小實(shí)蠅血淋巴中存在可能的“誘導(dǎo)因子”調(diào)控橘小實(shí)蠅的RNAi免疫耐受反應(yīng)，并且該“誘導(dǎo)因子”具有熱不穩(wěn)定性而在室溫下能較長(zhǎng)時(shí)間保持誘導(dǎo)能力。
　　2.通過比較免疫組和對(duì)照組橘小實(shí)蠅血淋巴中各種化學(xué)組分的含量，發(fā)現(xiàn)免疫組橘小實(shí)蠅血淋巴中亞油酸:花生四烯酸的比例上升。通過免疫組和對(duì)照組橘小實(shí)蠅血淋巴代謝組學(xué)分析，我們一共鑒定出37種表達(dá)量有差異的代謝產(chǎn)物，其中17中代謝產(chǎn)物在免疫組血淋巴中含

5、量顯著升高，另外20種在對(duì)照組血淋巴中含量較高。在所有鑒定出的代謝產(chǎn)物中，含有14種磷脂和11種不同鏈長(zhǎng)及飽和程度的脂肪酸，差異代謝產(chǎn)物中脂質(zhì)所占比例達(dá)到了67.57％。進(jìn)一步分析代謝組的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，在免疫組橘小實(shí)蠅血淋巴中亞油酸:花生四烯酸的比值為11.5∶1，顯著高于對(duì)照組中的9.8∶1，表明花生四烯酸的含量相對(duì)減少了。我們將免疫組血淋巴中含量較高的物質(zhì)分別注射進(jìn)未經(jīng)處理的橘小實(shí)蠅中并喂食dsRNA，發(fā)現(xiàn)注射亞油酸后可以誘導(dǎo)橘小實(shí)蠅對(duì)

6、RNAi的免疫耐受反應(yīng)。注射濃度為100μM和200μM的亞油酸后喂食dsRNA完全不能引起目的基因的下調(diào);注射濃度為50μM的亞油酸后再喂食dsRNA，導(dǎo)致目的基因轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)30％，而注射DMSO的對(duì)照組中目的基因表達(dá)量降低了55％，與注射50μM亞油酸的處理組間存在顯著差異。這些結(jié)果表明亞油酸在橘小實(shí)蠅中誘導(dǎo)的RNAi免疫耐受反應(yīng)隨注射濃度的降低而減弱。注射200μM亞油酸后，橘小實(shí)蠅對(duì)RNAi的阻礙效果可以持續(xù)48 h。同時(shí)我們

7、檢測(cè)了注射200μM亞油酸后橘小實(shí)蠅中胞吞相關(guān)基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)bet3、pi3k、ninac、vha16-1、vha-sfd、arf72a和ap50等基因出現(xiàn)了25％-65％的下調(diào)。免疫熒光染色的結(jié)果也顯示，注射亞油酸導(dǎo)致dsRNA分子不能正常通過胞吞作用進(jìn)入橘小實(shí)蠅腸道細(xì)胞中。我們?cè)谝衙庖唛傩?shí)蠅中注射濃度為50μM、100μM以及200μM花生四烯酸再喂食dsRNA，結(jié)果顯示靶標(biāo)基因分別下調(diào)了50％、67％和46％。同時(shí)在已免疫橘小

8、實(shí)蠅中，注射200μM花生四烯酸后胞吞相關(guān)基因的表達(dá)，如chc、rab7、arf72a、ap50和vha-sfd，也較注射DMSO的對(duì)照組中均出現(xiàn)了40％-57％的上調(diào)。之前的研究表明果蠅中喂食dsRNA不能誘導(dǎo)RNAi效應(yīng)，根據(jù)上面的結(jié)果，我們將花生四烯酸注射進(jìn)果蠅然后喂食dsRNA，發(fā)現(xiàn)靶標(biāo)基因下調(diào)了44％。免疫熒光染色的結(jié)果也表明注射花生四烯酸后，dsRNA分子能順利進(jìn)入果蠅腸道細(xì)胞內(nèi)。
　　3.轉(zhuǎn)錄組和蛋白組的研究發(fā)現(xiàn)脂肪

9、酸合成代謝通路在橘小實(shí)蠅RNAi免疫耐受中起重要的調(diào)控作用。我們分別將對(duì)照組和免疫組橘小實(shí)蠅的早期和晚期樣本進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組和蛋白組分析，篩選差異表達(dá)的基因和蛋白。早期樣本中免疫組相較于對(duì)照組共有1204個(gè)基因和72個(gè)蛋白表達(dá)量上調(diào)，1343個(gè)基因和43個(gè)蛋白的表達(dá)量下調(diào);晚期樣本中免疫組相較于對(duì)照組有844個(gè)基因和68個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào)，1119個(gè)基因和79個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào)。對(duì)測(cè)序得到的差異表達(dá)基因和蛋白的結(jié)果進(jìn)行GO富集分析結(jié)果表明在生物學(xué)過

10、程分類中，早期差異表達(dá)的基因和蛋白富集到了265個(gè)GO條目，分為14簇，包括生長(zhǎng)發(fā)育、大分子代謝以及脂肪酸代謝等生物學(xué)過程;晚期樣本的差異表達(dá)基因和蛋白富集到了132個(gè)GO條目，分為12簇，包括磷脂代謝，跨膜運(yùn)輸，含氮化合物代謝等生物學(xué)過程。結(jié)合代謝組、轉(zhuǎn)錄組與蛋白組的結(jié)果發(fā)現(xiàn)脂肪酸合成與代謝通路對(duì)橘小實(shí)蠅RNAi免疫耐受起重要的調(diào)控作用。選取了該通路上的關(guān)鍵基因fasn，利用“RNAi of RNAi”的方法檢測(cè)該基因在橘小實(shí)蠅對(duì)RN

11、Ai的免疫耐受中的作用。干擾fasn后喂食ds-rpl19，并于5d后第二次喂食dsRNA，結(jié)果顯示，fasn干擾組目的基因表達(dá)量下調(diào)了50％，而對(duì)照組則在第二次喂食dsRNA后未出現(xiàn)明顯的RNAi效應(yīng)。
　　4.脂肪酸合成代謝通路上編碼脂肪酸延伸酶ELOVL6的關(guān)鍵基因noa調(diào)控橘小實(shí)蠅體液免疫通路的啟動(dòng)?？寺〉玫降拈傩?shí)蠅noa基因全長(zhǎng)1608 bp，包括990bp的開放閱讀框，編碼包含329個(gè)氨基酸的蛋白。表達(dá)模式的研究結(jié)果

12、表明noa基因在各個(gè)發(fā)育時(shí)期均有表達(dá)，其中胚胎期表達(dá)最高;在檢測(cè)的不同組織中，noa在精巢中的相對(duì)表達(dá)量最高，其次是卵巢。利用RNAi干擾noa基因的表達(dá)后，檢測(cè)到Toll通路上的MyD88和defensin分別在喂食ds-noa后第2d和第4d出現(xiàn)最大50％和74％的下調(diào);Imd通路上的realish和diptericin的表達(dá)在noa干擾后第2 d出現(xiàn)最大分別為63％和65％的下調(diào)。并且單增李斯特菌(Listeriamonocyto

13、genes)、金黃葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和大腸桿菌(Escherichiacoli)感染橘小實(shí)蠅后，noa基因的表達(dá)量會(huì)出現(xiàn)上調(diào)。喂食ds-noa后分別注射L.monocytogenes和S.aureus，MyD88和defensin在注射菌液后6h、12h和24 h的表達(dá)均較喂食ds-egfp再注射菌液的對(duì)照組有顯著下調(diào)。而干擾noa之后注射L.monocytogenes和E.coli，realish和