馬病毒性動(dòng)脈炎兩種快速診斷方法的建立和應(yīng)用.pdf

1、馬病毒性動(dòng)脈炎(Equineviralarteritis，EVA)是由馬動(dòng)脈炎病毒引起的一種通過(guò)呼吸道或生殖器官傳播的傳染病，是危害養(yǎng)馬業(yè)的重大疾病之一，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列入檢疫名錄。近年來(lái)，我國(guó)社會(huì)經(jīng)濟(jì)不斷發(fā)展和人們生活水平不斷提高，養(yǎng)馬和賽馬越來(lái)越多，馬術(shù)比賽國(guó)際化交流日益增多，該病的傳播風(fēng)險(xiǎn)也越來(lái)越高。馬病毒性動(dòng)脈炎國(guó)際貿(mào)易指定診斷方法為病毒分離（僅精液）和中和試驗(yàn)，這兩種診斷方法檢測(cè)技術(shù)要求高、檢測(cè)周期長(zhǎng)，不利于對(duì)該

2、病的快速應(yīng)對(duì)和防控。為防止該病的傳入，有必要建立和應(yīng)用快速、高效、操作簡(jiǎn)便的診斷方法。本研究分別針對(duì)馬病毒性動(dòng)脈炎的抗體和病原建立了兩種快速診斷方法，彌補(bǔ)了國(guó)際貿(mào)易指定方法的缺點(diǎn)，為該病的防控提供了技術(shù)支撐。
　　1、間接ELISA抗體檢測(cè)方法應(yīng)用RT-PCR技術(shù)，以馬動(dòng)脈炎病毒基因組模板擴(kuò)增出馬動(dòng)脈炎病毒N基因，將N基因插入到pET-32a原核表達(dá)獲得約30kD的N蛋白，Western-blotting結(jié)果顯示N蛋白具有良好抗原

3、性，通過(guò)鎳柱純化獲得N蛋白，在此基礎(chǔ)上建立了馬動(dòng)脈炎病毒抗體間接ELISA診斷方法，制訂了標(biāo)準(zhǔn)操作程序。
　　應(yīng)用建立的間接ELSIA診斷方法對(duì)2010年至2012年來(lái)自吉林、北京、天津、廣東等6個(gè)不同地區(qū)疑似馬病毒性動(dòng)脈炎血清557份進(jìn)行抗體檢測(cè)，檢出馬動(dòng)脈炎病毒抗體陽(yáng)性血清11份，與病毒中和抗體檢測(cè)結(jié)果完全相符。
　　2、RT-LAMP病毒檢測(cè)方法針對(duì)馬動(dòng)脈炎病毒的膜基質(zhì)蛋白M基因保守序列，設(shè)計(jì)特異性引物，優(yōu)化反應(yīng)條件，

4、建立了馬動(dòng)脈炎病毒的RT-LAMP診斷方法。
　　2010年至2012年應(yīng)用所建立的馬動(dòng)脈炎病毒RT-LAMP檢測(cè)方法，在新疆、遼寧、黑龍江、內(nèi)蒙古等4個(gè)省進(jìn)行應(yīng)用，2年時(shí)間檢測(cè)精液、全血等樣品1826份，共計(jì)檢測(cè)出陽(yáng)性9頭份，對(duì)陽(yáng)性馬及時(shí)采取隔離和撲殺等措施，防止了馬動(dòng)脈炎病的傳入境內(nèi)。
　　該方法已經(jīng)制訂成寧波局標(biāo)準(zhǔn)。研發(fā)的馬動(dòng)脈炎病毒的RT-LAMP診斷試劑盒專利正在申報(bào)中（已經(jīng)受理，申請(qǐng)?zhí)?201210056298.