馬病毒性動脈炎兩種快速診斷方法的建立和應用.pdf

1、馬病毒性動脈炎(Equineviralarteritis，EVA)是由馬動脈炎病毒引起的一種通過呼吸道或生殖器官傳播的傳染病，是危害養(yǎng)馬業(yè)的重大疾病之一，被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列入檢疫名錄。近年來，我國社會經(jīng)濟不斷發(fā)展和人們生活水平不斷提高，養(yǎng)馬和賽馬越來越多，馬術比賽國際化交流日益增多，該病的傳播風險也越來越高。馬病毒性動脈炎國際貿易指定診斷方法為病毒分離（僅精液）和中和試驗，這兩種診斷方法檢測技術要求高、檢測周期長，不利于對該

2、病的快速應對和防控。為防止該病的傳入，有必要建立和應用快速、高效、操作簡便的診斷方法。本研究分別針對馬病毒性動脈炎的抗體和病原建立了兩種快速診斷方法，彌補了國際貿易指定方法的缺點，為該病的防控提供了技術支撐。
　　1、間接ELISA抗體檢測方法應用RT-PCR技術，以馬動脈炎病毒基因組模板擴增出馬動脈炎病毒N基因，將N基因插入到pET-32a原核表達獲得約30kD的N蛋白，Western-blotting結果顯示N蛋白具有良好抗原

3、性，通過鎳柱純化獲得N蛋白，在此基礎上建立了馬動脈炎病毒抗體間接ELISA診斷方法，制訂了標準操作程序。
　　應用建立的間接ELSIA診斷方法對2010年至2012年來自吉林、北京、天津、廣東等6個不同地區(qū)疑似馬病毒性動脈炎血清557份進行抗體檢測，檢出馬動脈炎病毒抗體陽性血清11份，與病毒中和抗體檢測結果完全相符。
　　2、RT-LAMP病毒檢測方法針對馬動脈炎病毒的膜基質蛋白M基因保守序列，設計特異性引物，優(yōu)化反應條件，

4、建立了馬動脈炎病毒的RT-LAMP診斷方法。
　　2010年至2012年應用所建立的馬動脈炎病毒RT-LAMP檢測方法，在新疆、遼寧、黑龍江、內蒙古等4個省進行應用，2年時間檢測精液、全血等樣品1826份，共計檢測出陽性9頭份，對陽性馬及時采取隔離和撲殺等措施，防止了馬動脈炎病的傳入境內。
　　該方法已經(jīng)制訂成寧波局標準。研發(fā)的馬動脈炎病毒的RT-LAMP診斷試劑盒專利正在申報中（已經(jīng)受理，申請?zhí)?201210056298.