三種豬病毒性腹瀉病原檢測方法和PEDV間接ELISA方法的建立與初步應(yīng)用.pdf

1、豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea,PED）、豬傳染性胃腸炎（Transmissible gastroenteritis,TGE）、豬輪狀病毒?。≒orcine rotavirus disease,RVD）是豬場常見的病毒性腹瀉，分別由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis v

2、irus,TGEV）及豬輪狀病毒（Porcine rotavirus，RV）引起的，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。三種病毒引起的腹瀉具有類似的傳染途徑和臨床癥狀，感染豬臨床均表現(xiàn)為水樣腹瀉、嘔吐、脫水及新生仔豬的高死亡率，三者流行病學(xué)和病理剖檢也極其相似，但三種病原沒有共同的抗原性，不能交互免疫，而又有混合感染，也易繼發(fā)其他細(xì)菌性感染，導(dǎo)致仔豬死亡率升高或生長緩慢。目前，常規(guī)的診斷方法如病毒分離、血清學(xué)診斷方法等存在著耗時長、敏感度低的

3、缺陷，已不能滿足現(xiàn)實(shí)臨床診斷需要。多重 PCR方法具有敏感性高且可以一次檢測多種病原的優(yōu)勢，更適于混合感染的快速診斷。在臨床檢測時發(fā)現(xiàn)進(jìn)行了免疫的豬群會出現(xiàn) PED現(xiàn)象，為了檢測山東省豬場PEDV免疫水平，對免疫豬進(jìn)行抗體檢測，免疫后的抗體的跟蹤檢測，建立了針對S基因主要抗原表位的原核表達(dá)，并利用S90蛋白建立了間接ELISA方法。本研究共分為3部分：
　　1.PEDV-TGEV-RV多重PCR方法建立
　　本文進(jìn)行了PED

4、V、TGEV和RV多重RT-PCR檢測方法的研究。根據(jù)近幾年來山東主要流行株P(guān)EDV、TGEV和RV的保守基因M、N和VP7分別設(shè)計了特異性引物，分別擴(kuò)增出預(yù)期的311bp、763bp和516bp的目的片段，成功建立同時檢測豬三種常見病毒感染的多重PCR方法。通過敏感性和特異性的試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)本方法對PEDV的最高敏感度為30pg，TGEV的最高敏感度為18pg，RV的最高敏感度為42pg，并通過對其他常見幾種病原進(jìn)行PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)本方法

5、特異性良好，可以應(yīng)用于臨床樣品檢測。利用該檢測方法對2015年到2016年來自山東省濟(jì)南、泰安、萊蕪等發(fā)病豬場的412份臨床病料進(jìn)行檢測，結(jié)果表明PEDV、TGEV和RV的陽性率分別為22.3％、7.28%和1.46%，PEDV與TGEV、PEDV與RV、TGEV與RV雙重混合感染陽性率分別為5.34%、1.94%和2.91%，PEDV、TEGV和RV三重感染陽性率為4.85%。同時用文獻(xiàn)報道的單一RT-PCR法對以上樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果

6、符合率為100%。結(jié)果表明，建立的三重 RT-PCR具有較敏感度和特異性，可用于臨床PEDV、TGEV和RV的檢測。
　　2.PEDV S90基因的原核表達(dá)與條件優(yōu)化
　　本試驗(yàn)設(shè)計一對引物，以PEDV山東流行毒株為擴(kuò)增模板，擴(kuò)增了PEDV的S基因的主要抗原表位區(qū)，并連接到原核表達(dá)載體pET-32a(+)，構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒，導(dǎo)入表達(dá)菌E.coli BL21(DE3)，通過對表達(dá)時間，誘導(dǎo)劑的使用量等條件的摸索，使構(gòu)建的pE

7、T32a-S90質(zhì)粒在宿主菌中大量穩(wěn)定的進(jìn)行蛋白表達(dá)，通過對優(yōu)化條件的摸索得出：最佳的表達(dá)條件誘導(dǎo)劑IPTG終濃度為1mmol/mL的，37℃，220rpm，誘導(dǎo)表達(dá)6h時蛋白表達(dá)量最大。經(jīng)過對菌體蛋白純化獲得純度較高的目的蛋白，Western blot檢測表明，表達(dá)的重組S90蛋白能與PEDV陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，不與其他常見豬病陽性血清發(fā)生反應(yīng)，說明該蛋白具有一定的反應(yīng)原性。
　　3.PEDV間接ELISA方法的建立和初步應(yīng)

8、用
　　利用純化的原核表達(dá) S90蛋白為包被抗原，建立了檢測豬體內(nèi)PEDV抗體的間接ELISA方法。優(yōu)化條件為S90蛋白最佳包被量為2μg/mL，4℃孵育過夜，最佳包被液為5%脫脂奶粉，被檢血清最佳稀釋度為1:100，抗體最佳反應(yīng)時間為37℃2h，二抗按1:4000稀釋，37℃1.5h，顯色液的最佳終止時間為室溫15min，陽性的Cut-off值為0.204。以建立的間接ELISA方法對采山東省萊蕪2個未免疫豬場120頭豬進(jìn)行抗體