咯菌腈對油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)的作用機(jī)制研究.pdf

1、油菜菌核病是由核盤菌（Sclerotiniasclerotiorum）引起的一種分布較廣、破壞性較強的世界性病害，該病不僅減少了油菜的產(chǎn)量，而且降低了油菜的品質(zhì)，給世界油菜生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前，油菜菌核病仍是以化學(xué)防治為主。但是隨著單一殺菌劑的長期使用，田間抗性菌株分布范圍逐年擴(kuò)大，抗性群體比例不斷上升，最終導(dǎo)致了該病防效下降?？┚?fludioxonil)是一種苯吡咯類非內(nèi)吸性廣譜殺菌劑，對油菜菌核病具有較好的田間防治效果

2、。而目前，咯菌腈用于油菜菌核病的防治在我國尚未進(jìn)行登記，同時，咯菌腈對核盤菌的作用機(jī)制尚不清楚。因此，本文開展了咯菌腈對油菜菌核病菌的作用機(jī)制研究，探索了油菜菌核病菌對咯菌腈的抗性機(jī)理。
　　本文測定了咯菌腈對油菜菌核病菌的毒力及作用方式，結(jié)果表明:咯菌腈對油菜菌核病菌具有較高的殺菌活性，測定的270個菌株的平均EC50為0.015±0.003μg/mL?？┚鎸τ筒司瞬【z生長具有強烈的抑制作用，能使菌絲細(xì)胞膨大、原生質(zhì)收縮

3、、外滲;在生理生化特性上也表現(xiàn)出明顯的變化:細(xì)胞膜透性、菌絲甘油含量、POD和PAL活性顯著增加，但草酸及胞外多糖含量則顯著降低;咯菌腈在油菜上沒有內(nèi)吸疏導(dǎo)性，對油菜菌核病具有顯著的保護(hù)治療作用，且保護(hù)作用高于治療作用。
　　通過室內(nèi)藥劑馴化獲得油菜菌核病菌對咯菌腈抗性菌株，這些菌株抗性能穩(wěn)定遺傳，對菌核凈、異菌脲、嘧霉胺、甲基立枯磷存在交互抗性，但與苯并咪唑類殺菌劑多菌靈無交互抗性;咯菌腈抗性菌株生長速率減慢，菌絲干重下降，產(chǎn)菌

4、核能力降低，致病力下降，對滲透壓（高糖、高鹽）較為敏感;細(xì)胞膜透性、甘油含量、草酸量、PAL和POD活性顯著增加，但是胞外多糖含量并沒有顯著差異。
　　在粗糙脈孢菌和小麥赤霉菌中，os-1、os-2、os-4和os-5基因與二甲酰亞胺類藥劑抗性有關(guān)，在灰霉菌中，只有os-1與二甲酰亞胺類藥劑抗性有關(guān)，且二甲酰亞胺類藥劑與苯吡咯類藥劑存在正交互抗性。因此，對油菜菌核病菌雙組分組氨酸激酶途徑中的4個關(guān)鍵激酶基因進(jìn)行鑒定及克隆，分別命名

5、為:Shk1(SS1G_12694)、SsHOG1(SS1G_07590)、SsOS4(SS1G_06598)和SsOS5(SS1G_14143)。同時，對實驗室誘導(dǎo)的咯菌腈抗性菌株及其親本菌株的Shk1、SsHOG1、SsOS4和SsOS5基因分別進(jìn)行克隆、測序比對，結(jié)果顯示僅在Shk1基因上發(fā)生了點突變或移碼突變。我們也測定了咯菌腈、菌核凈對油菜菌核病菌雙組分組氨酸激酶途徑中4個激酶基因的表達(dá)影響，結(jié)果顯示:藥劑處理后，Shk1及S

6、sOS4基因表達(dá)均顯著下調(diào)，而SsHOG1及SsOS5基因表達(dá)均顯著上調(diào)。
　　通過雙向電泳分離技術(shù)建立了油菜菌核病菌蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜，研究了咯菌腈對油菜菌核病菌蛋白質(zhì)組學(xué)的影響。結(jié)果表明，在成功鑒定的33個蛋白點中，8個為能量代謝相關(guān)蛋白，7個為氨基酸代謝相關(guān)蛋白，5個為調(diào)控相關(guān)蛋白，14個為功能未知蛋白。但由于這些蛋白的功能大多在油菜菌核病菌上尚未報道，其功能還需進(jìn)一步的驗證。通過咯菌腈對野生型敏感菌株HA61蛋白質(zhì)組的影響

7、，分析咯菌腈對油菜菌核病菌可能存在的作用途徑，為探索咯菌腈對油菜菌核病菌的作用機(jī)制具有重要的參考價值。
　　本文初步建立了直接以菌絲為受體的核盤菌原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)體系，并構(gòu)建了含有新霉素抗性基因的真核表達(dá)載體。將含有構(gòu)巢曲霉（Aspergillusnidulans）trpC基因的啟動區(qū)和終止區(qū)的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因片段（HPH）和以雙元表達(dá)載體pCAMBIA1300為基本骨架構(gòu)建的含有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（NEO）的表達(dá)載體p

8、NEO分別轉(zhuǎn)化至供試菌株中，PCR驗正轉(zhuǎn)化子。結(jié)果表明，制備核盤菌原生質(zhì)體的條件:培養(yǎng)菌絲的最適培養(yǎng)基為YEPD;菌絲培養(yǎng)時間為36h;裂解酶為Lysingenzymes;最佳酶解緩沖液為0.8mol/L甘露醇的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。PCR驗正轉(zhuǎn)化子表明，HPH和NEO基因已成功插入轉(zhuǎn)化子的基因組中。該技術(shù)體系不僅為研究核盤菌基因功能及構(gòu)建核盤菌突變體文庫提供一種重要的技術(shù)保障，而且也適用于其他病原絲狀真菌。
　　雙組分信號途徑

9、參與調(diào)控滲透壓和氧化壓脅迫、菌絲生長、致病性和殺菌劑抗性等功能，有人推測，苯吡咯類藥劑作用機(jī)制和抗性機(jī)理很可能與雙組分信號途徑密切相關(guān)。因此，在本研究中，利用油菜菌核病菌原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)平臺，分別對油菜菌核病菌雙組分信號途徑中4個關(guān)鍵激酶基因Shk1、SsHOG1、SsOS4和SsOS5及p21蛋白活化激酶基因SsPAK進(jìn)行了敲除，并對其進(jìn)行了表型功能分析，結(jié)果表明:
　　1.Shk1基因敲除突變體對滲透壓及氧化壓的敏感性增大

10、，對苯吡咯類及二甲酰亞胺類殺菌劑的抗性增強;菌絲生長速率有所減慢、菌絲頂端分支增多，菌絲生長致密，氣生菌絲增多，不能形成菌核;菌絲細(xì)胞膜透性顯著增大。菌絲甘油測定結(jié)果顯示Shk1基因調(diào)控著甘油的合成和積累。通過對SsHOG1和SsPAK基因的熒光定量PCR測定表明，Shk1基因調(diào)控著SsHOG1基因的表達(dá)，而對SsPAK基因的表達(dá)則無影響。與親本菌株相比，Shk1缺失突變體對寄主植物的致病力上沒有顯著差異。通過互補試驗，Shk1缺失突變

11、體的所有生物學(xué)表型都得到了恢復(fù)。綜上所述，Shk1基因參與調(diào)控著菌絲生長分化、菌核形成、滲透壓敏感性、殺菌劑抗性等;同時，也調(diào)控著菌絲胞內(nèi)甘油的合成、積累及SsHOG1基因的表達(dá)。
　　2.SsOS4敲除突變體菌絲生長緩慢，菌絲較細(xì)，不形成菌核，完全喪失致病力;對NaCl和葡萄糖產(chǎn)生的滲透壓、過氧化氫產(chǎn)生的氧化壓及所有金屬離子脅迫均表現(xiàn)為敏感，而對苯吡咯類藥劑咯菌腈和二甲酰胺類藥劑菌核凈和異菌脲表現(xiàn)為抗性。在細(xì)胞膜透性上，SsOS

12、4敲除突變體始終大于親本菌株，但用藥劑處理后，親本菌株HA61細(xì)胞膜透性顯著增大，而SsOS4敲除突變體變化幅度較小。qRT-PCR結(jié)果表明:與親本菌株相比，SsOS4敲除突變體中SsHOG1和SsOS5基因的表達(dá)量均上升。在藥劑處理下，SsOS5和SsHOG1基因的表達(dá)量在親本菌株中均顯著上升，而在SsOS4敲除突變體中無顯著變化。通過互補試驗，SsOS4缺失突變體的所有生物學(xué)表型都得到了恢復(fù)。由此我們得出，SsOS4基因參與調(diào)控著菌

13、絲生長分化、菌核形成、各種外界脅迫壓力的敏感性、殺菌劑抗性及致病力等功能。
　　3.SsOS5敲除突變體菌絲扭曲畸形，頂端分支增多，致病力顯著下降，但生長速率無變化;對NaCl產(chǎn)生的離子滲透壓、過氧化氫產(chǎn)生的氧化壓及鋅離子脅迫均表現(xiàn)為敏感，對葡萄糖產(chǎn)生的中性滲透壓及其它金屬離子脅迫敏感性無變化;對苯吡咯類藥劑咯菌腈和二甲酰胺類藥劑菌核凈表現(xiàn)為更加敏感。在細(xì)胞膜透性上，SsOS5基因敲除后，細(xì)胞膜的通透性并無變化;當(dāng)用藥劑處理后，親

14、本菌株的細(xì)胞膜透性顯著增大，而SsOS5敲除突變體則無顯著變化。在菌絲甘油合成上，SsOS5敲除突變體菌絲甘油含量大于親本菌株。當(dāng)用藥劑處理后，親本菌株菌絲甘油含量顯著增加，而SsOS5敲除突變體菌絲甘油含量無顯著變化。qRT-PCR結(jié)果表明:SsHOG1基因在SsOS5敲除突變體與親本菌株的表達(dá)水平上無差異，但在藥劑處理后，SsHOG1基因在親本菌株上的表達(dá)量顯著上升，而在SsOS5敲除突變體上的表達(dá)量顯著下降，表達(dá)量較微弱。通過互補

15、試驗，SsOS5缺失突變體的所有生物學(xué)表型都得到了恢復(fù)。這說明SsOS5基因是致病相關(guān)基因，參與調(diào)控著菌絲的生長與分化、滲透壓敏感性等功能。
　　4.SsHOG1敲除突變體菌絲扭曲畸形，頂端分支增多，但致病力，生長速率及外界脅迫壓力的敏感性均無變化，對苯吡咯類藥劑咯菌腈和二甲酰胺類藥劑菌核凈和異菌脲敏感性降低。在細(xì)胞膜透性上，，sHOG1敲除突變體大于親本菌株，當(dāng)用藥劑處理后，親本菌株的細(xì)胞膜透性顯著增大，而SsHOG1敲除突變體

16、則無顯著變化。在菌絲甘油合成上，SsHOG1敲除突變體與親本菌株菌絲甘油含量無差異。當(dāng)用藥劑處理后，兩者菌絲甘油含量均顯著增加。
　　5.SsPAK基因敲除突變體對NaCl產(chǎn)生的離子滲透壓、過氧化氫產(chǎn)生的氧化壓及苯吡咯類及二甲酰亞胺類殺菌劑的敏感性均增大;對不同的金屬離子脅迫也表現(xiàn)出不同的敏感性;但菌絲生長速率、菌絲及菌落形態(tài)、菌核形成及致病力上卻無變化。在細(xì)胞膜透性測定上，SsPAK基因敲除突變體對殺菌劑壓力脅迫無變化，而野生菌

17、株則顯著升高。菌絲甘油測定結(jié)果顯示SsPAK基因參與調(diào)控著甘油的合成和積累。通過對SsOS4、SsOS5和SsHOG1基因的表達(dá)測定，結(jié)果表明:SsPAK基因敲除后，SsOS4和SsOS5基因顯著上升，而SsHOG1基因表達(dá)則不變化。通過互補試驗，SsPAK缺失突變體的所有生物學(xué)表型都得到了恢復(fù)。
　　6.這些結(jié)果表明，油菜菌核病菌上述基因的功能與其他病原真菌相應(yīng)的基因功能存在較大的差異。由于SsOS4和SsOS5基因是致病相關(guān)基