西南地區(qū)油菜菌核病菌對多菌靈、菌核凈的抗性監(jiān)測及抗性機理.pdf

1、油菜（Brassica campestris）是我國的主要油料作物之一，而油菜菌核?。⊿clerotiniasclerotiorum）位于油菜三大病害之首。長期以來，我國對油菜菌核病的防治手段主要依靠以多菌靈為代表的苯并咪唑類殺菌劑和以菌核凈為代表的二甲酰亞胺類殺菌劑等化學(xué)藥劑防治。但是由于近年來大面積、長時間的使用，以及多菌靈自身殺菌機制單一等多重原因，使油菜菌核病菌對多菌靈的抗性種群大量產(chǎn)生，導(dǎo)致部分油菜種植區(qū)內(nèi)苯并咪唑類殺菌劑防效

2、的大幅度降低，甚至失效。在以往部分地區(qū)的菌核凈抗性監(jiān)測中雖然沒有發(fā)現(xiàn)大量的抗性菌株，但是仍然在不同的省市發(fā)現(xiàn)油菜菌核病對菌核凈的抗性菌株。為了掌握西南地區(qū)油菜菌核病菌對多菌靈和菌核猙的抗藥性動態(tài)，對四川省、貴州省、重慶市的主要油菜種植地進行了多菌靈和菌核凈的抗藥性監(jiān)測以及抗性機理的初步研究。
　　采用菌絲生長速率法測定了104株油菜菌核病菌菌株對多菌靈的敏感性，EC50值變化范圍為0.00912～0.1827μg/mL，最不敏感菌

3、株的EC50值是最敏感菌株的20倍，平均EC50值為0.06705±0.03423μg/mL。104株油菜菌核病菌對多菌靈的敏感性頻率分布呈連續(xù)單峰曲線，接近正態(tài)分布，沒有出現(xiàn)敏感性下降的抗性群體，這些菌株均為多菌靈敏感菌株，因此可以采用這些菌株的平均EC50值作為西南地區(qū)油菜菌核病菌對多菌靈的敏感性基線。以5μg/ml作為鑒別劑量，對2013-2014年從四川省、貴州省、重慶市的共16個區(qū)縣采集得到的1292株油菜菌核病菌進行多菌靈田

4、間抗性監(jiān)測，結(jié)果顯示，西南地區(qū)的油菜菌核病菌對多菌靈仍然以敏感菌株為主，僅監(jiān)測到3株多菌靈田間抗性菌株，抗性頻率為0.23％，3株多菌靈田間抗性菌株的EC50值分別為140.25μg/mL、254.48μg/mL以及大于1000μg/mL，抗性倍數(shù)分別為2091倍、3795以及大于10000倍，均為高抗菌株。以引物B1-1/B3-1PCR擴增3個抗性菌株的β-微管蛋白基因片段，與標準菌株1980的β-微管蛋白基因進行比對，發(fā)現(xiàn)多菌靈抗性

5、菌株β-微管蛋白基因在第593位堿基A變成C，相應(yīng)的其198位氨基酸由谷氨酸變成丙氨酸。
　　采用菌絲生長速率法測定了106株油菜菌核病菌菌株對菌核凈的敏感性，EC50值變化范圍為0.0161～1.0077μg/mL，最不敏感菌株的EC50值是最敏感菌株的62倍，平均EC50值為0.3209±0.1912μg/mL。106株油菜菌核病菌對菌核凈的敏感性頻率分布呈連續(xù)單峰曲線，接近正態(tài)分布，沒有出現(xiàn)敏感性下降的抗性群體，這些病菌均為

6、菌核凈敏感菌株，因此可以采用這些菌株的EC50值作為油菜菌核病菌對菌核凈的敏感基線;以5μg/ml作為鑒別劑量，對2013-2014年從四川省、貴州省、重慶市的共16個區(qū)縣采集得到的1292株油菜菌核病菌進行菌核凈田間抗性監(jiān)測。結(jié)果表明，西南地區(qū)的油菜菌核病菌對菌核凈仍然以敏感菌株為主，僅監(jiān)測到2株菌核凈田間抗性菌株，抗性頻率為0.15％。2株菌核凈抗性菌株EC50分別為131.1μg/mL、27.65μg/mL，抗性倍數(shù)分別為408倍

7、和86倍，為高抗菌株和中抗菌株。
　　為了進一步了解油菜菌核病菌對菌核凈的抗性機理，通過藥劑馴化得到室內(nèi)菌核凈抗性突變菌株。將田間抗性和室內(nèi)抗性菌株在不含藥的PDA培養(yǎng)基上面進行連續(xù)轉(zhuǎn)代培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)菌株對菌核凈的抗性水平?jīng)]有顯著性的降低，說明菌株對菌核凈的抗性是可以比較穩(wěn)定的遺傳;測定田間及室內(nèi)抗性菌株與敏感菌株的生活力，結(jié)果表明:菌核凈抗性菌株產(chǎn)生菌核數(shù)量以及菌絲生長速度明顯低于敏感菌株，但單個菌核重量比野生菌株大;致病性測定結(jié)果

8、表明，對菌核凈不同抗性的油菜菌核病菌對離體油菜葉片的致病力存在差異，敏感菌株致病能力最強，田間抗性菌株次之，室內(nèi)抗性菌株最差;比較抗性、敏感性菌株在含有不同濃度的NaCl或者葡萄糖的PDA培養(yǎng)基上的生長速率，結(jié)果表明，菌核凈抗性菌株對外界環(huán)境的滲透壓更敏感;交互抗性測定結(jié)果表明，菌核凈抗性菌株對啶酰菌胺、戊唑醇、乙霉威以及嘧菌酯不存在交互抗性，但是對腐霉利和咯菌腈存在正交互抗性。
　　根據(jù)已報道的油菜菌核病菌雙組分組氨酸激酶編碼序

9、列Shk1(SS1G_12694)設(shè)計引物AA1F/AA1R擴增抗性菌株的雙組分組氨酸激酶編碼基因部分片段，測序比對分析，發(fā)現(xiàn)不同室內(nèi)抗性菌株的Shk1基因的不同位點發(fā)生了不同的突變:菌株XN29R的637位堿基由C變?yōu)镚，相應(yīng)的213位氨基酸由丙氨酸變?yōu)楦拾彼幔硗?049位堿基由G變?yōu)門，1051位堿基由T變?yōu)镚，相應(yīng)的311位氨基酸由天冬氨酸變?yōu)榻K止密碼子;菌株XN31R的1049位堿基由G變?yōu)門，1051位堿基由T變?yōu)镚，相應(yīng)的

10、311位氨基酸由天冬氨酸變?yōu)榻K止密碼子;菌株XN43R的1034位堿基由C變?yōu)門，1035位堿基由C變?yōu)锳，相應(yīng)的305位氨基酸由蘇氨酸變?yōu)楫惲涟彼?。然而對田間抗性菌株Shk1基因的檢測結(jié)果卻不同，田間高抗菌株JR1-1中沒能擴增出Shk1基因部分片段片段，而中抗菌株JR1-2在Shk1基因部分基因片段中未沒有發(fā)現(xiàn)堿基突變。以上研究結(jié)果表明，Shk1基因上堿基突變導(dǎo)致對應(yīng)氨基酸變化可能是油菜菌核病菌菌核凈室內(nèi)誘導(dǎo)抗性菌株產(chǎn)生的原因，而田