灰氈毛忍冬新品種ISSR分子標(biāo)記及組織培養(yǎng)的研究.pdf

1、灰氈毛忍冬(Lonicera macranthoides Hand.-Mazz)又名擬大花忍冬、大銀花等，是忍冬科忍冬屬多年生半常綠小灌木植物，其花蕾綠原酸含量在全國(guó)各種藥用忍冬植物中最高，是湖南、重慶、貴州等地藥用忍冬植物生產(chǎn)的主栽品種。雖然我國(guó)藥用忍冬植物產(chǎn)業(yè)取得了長(zhǎng)足的發(fā)展，但是，仍存在著良種缺乏，品種混雜，干花產(chǎn)量和藥用活性成份綠原酸含量低，繁殖技術(shù)落后，育苗周期長(zhǎng)，繁殖系數(shù)小等系列問(wèn)題，從而制約了我國(guó)藥用忍冬植物產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)

2、發(fā)展。本文以灰氈毛忍冬新品種‘金翠蕾’、‘銀翠蕾’和‘白云’為研究對(duì)象，研究了灰氈毛忍冬新品種ISSR分子標(biāo)記和組織培養(yǎng)，系統(tǒng)地分析了新品種組織培養(yǎng)增殖分化及生根過(guò)程中的內(nèi)源激素、內(nèi)源多胺的變化規(guī)律和調(diào)控作用，旨有效地從分子水平鑒別灰氈毛忍冬新品種，建立新品種高效組培快繁技術(shù)體系，促進(jìn)我國(guó)藥用忍冬植物產(chǎn)業(yè)又好又快發(fā)展。主要研究結(jié)果如下：
　　 (1)灰氈毛忍冬新品種ISSR分子標(biāo)記的研究。以灰氈毛忍冬葉片基因組DNA為模板，研究

3、了退火溫度、Taq DNA聚合酶的用量及模板DNA、引物、dNTPs、Mg2+濃度等6種因素對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增的影響，建立了灰氈毛忍冬ISSR-PCR的優(yōu)化反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序。利用優(yōu)化的反應(yīng)體系，從100條ISSR引物中篩選出10條能夠擴(kuò)增出清晰、穩(wěn)定條帶的引物。以該10條引物對(duì)3個(gè)灰氈毛忍冬新品種和其它19個(gè)藥用忍冬植物品種基因組DNA擴(kuò)增，共擴(kuò)增出108條帶，其中多態(tài)性條帶96條，多態(tài)性條帶比率為88.9％，說(shuō)明藥用忍冬植物的遺

4、傳多樣性豐富。并利用該體系構(gòu)建3個(gè)灰氈毛忍冬新品種和其它19個(gè)藥用忍冬植物品種DNA指紋圖譜，可從分子水平將3個(gè)新品種與現(xiàn)在藥用忍冬植物品種進(jìn)行鑒別；利用UPGMA和主成分分析，將22個(gè)供試藥用忍冬植物品種劃分為忍冬種群和灰氈毛忍冬種群2個(gè)大類，每一大類又分為北方種群與南方種群。研究發(fā)現(xiàn)，不同藥用忍冬植物品種之間的遺傳差異與地理環(huán)境的差異存在相關(guān)性。
　　 (2)灰氈毛忍冬新品種組織培養(yǎng)的研究。以灰氈毛忍冬新品種金翠蕾、銀翠蕾和

5、白云為研究對(duì)象，采用單因素、雙因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，開展了外植體選擇、滅菌處理、基本培養(yǎng)基、植物激素及其配比、D-生物素濃度、活性炭濃度、培養(yǎng)溫度、移栽基質(zhì)、移栽容器、組培生根苗消毒處理、降低生產(chǎn)成本措施等系列試驗(yàn)，建立了組織培養(yǎng)的無(wú)菌體系，獲得了適宜的初代培養(yǎng)基：金翠蕾和銀翠蕾為MS+6-BA1.0mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1，白云則為MS+6-BA1.0 mg·L-1+IBA0.1 mg·L-1；篩選出適宜的繼代培養(yǎng)基

6、：金翠蕾為改良MS+6-BA0.5 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1+D-生物素1.0 mg·L-1，銀翠蕾為改良MS+6-BA0.5 mg·L-1+NAA0.05+D-生物素1.0 mg·L-1，白云則為改良MS+6-BA1.0 mg·L-1+IBA0.1 mg·L-1+D-生物素0.5 mg·L-1，平均增殖系數(shù)4.65；研究發(fā)現(xiàn)適當(dāng)?shù)蜏赜欣谡T導(dǎo)灰氈毛忍冬組培苗生根，找到了其組培苗生根培養(yǎng)的適宜溫度為20℃；篩選出3個(gè)品種

7、適宜的生根培養(yǎng)基是1/2MS+IBA3.0 mg·L-1+AC210 mg·L-1，平均生根率97.4％。同時(shí)以金翠蕾葉片為外植體，誘導(dǎo)出了愈傷組織和不定芽，篩選出了葉片誘導(dǎo)愈傷組織的最佳培養(yǎng)基為：B5+6-BA1.0 mg·L-1+2，4-D0.5 mg·L-1，愈傷組織誘導(dǎo)率為86.7％；誘導(dǎo)不定芽的最佳培養(yǎng)基為：B5+KT0.2 mg·L-1+NAA1.0mg·L-1，不定芽誘導(dǎo)率為73.4％。研究出組培苗“塑料杯單株一步移栽”技

8、術(shù)，適宜移栽基質(zhì)為黃心土+糠殼灰+細(xì)砂(1:2:2)，平均移栽達(dá)成活率達(dá)95％以上。用涼開水替代蒸餾水，白砂糖代替蔗糖配制培養(yǎng)基，可顯著降低了組培苗生產(chǎn)成本，提高了灰氈毛忍冬新品種工廠化育苗的生產(chǎn)效益。
　　 (3)灰氈毛忍冬新品種組培苗扦插繁殖技術(shù)的研究。以灰氈毛忍冬新品種‘金翠蕾，組培苗為試驗(yàn)材料，開展了不同的扦插基質(zhì)、扦插時(shí)期、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、ABT6濃度及浸泡時(shí)間對(duì)灰氈毛忍冬新品種組培苗扦插繁殖的影響試驗(yàn)，研究結(jié)果表明，

9、扦插基質(zhì)以泥炭土+珍珠巖(體積比1:3)為宜，適宜的扦插時(shí)期是5月和9月，適宜的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是300 mg·L-1的ABT6浸泡插穗120min，扦插成活率達(dá)95％以上，大幅度降低了灰氈毛忍冬新品種組培苗生產(chǎn)成本。
　　 (4)灰氈毛忍冬新品種組織培養(yǎng)過(guò)程內(nèi)源激素變化的研究。以金翠蕾組培苗為試驗(yàn)材料，分析了組培苗增殖分化、生根及愈傷組織和不定芽誘導(dǎo)過(guò)程的內(nèi)源激素含量變化，研究了6-BA濃度對(duì)繼代培養(yǎng)組培苗、IBA濃度對(duì)生根培養(yǎng)

10、組培苗內(nèi)源激素含量的影響。結(jié)果表明：①灰氈毛忍冬組培苗繼代增殖分化主要受內(nèi)源ZR、ABA和GA3調(diào)控，較高濃度的ZR、GA3和較低ABA有利于灰氈毛忍冬組培苗繼代增殖分化，適當(dāng)高濃度的IAA對(duì)叢芽增殖分化和生長(zhǎng)也有利，但作用不明顯，而較高IPA含量有利于灰氈毛忍冬外植體啟動(dòng)培養(yǎng)，但與增殖分化關(guān)系不密切。內(nèi)源激素平衡關(guān)系中是GA3/ZR值主導(dǎo)組培苗增殖分化，較高的GA3/ZR值有利于啟動(dòng)組培苗增殖分化和生長(zhǎng)，而增殖分化盛期則需要較低的GA

11、3/ZR值，GA3/ABA值也表現(xiàn)了類似效應(yīng)。②在灰氈毛忍冬組培苗不定根的形成過(guò)程中，不同的內(nèi)源激素對(duì)不定根形成的作用不同。較高濃度內(nèi)源IAA、ABA和較低濃度的內(nèi)源GA3、IPA、ZR有利于根原基的分化形成，促進(jìn)了組培苗不定根的形成。而較高濃度的內(nèi)源IAA、GA3、ZR、IPA和較低濃度的內(nèi)源ABA有利于根原基的生長(zhǎng)發(fā)育。內(nèi)源激素的平衡關(guān)系也協(xié)同參與灰氈毛忍冬組培苗根原基分化形成及生長(zhǎng)發(fā)育。較低的(ZR+IPA)/IAA值和較高的IA

12、A/ABA、ABA/GA3值有利于根原基的分化形成，較高(ZR+IPA)/IAA值和較低ABA/GA3值有助于根原基生長(zhǎng)發(fā)育。③不同的內(nèi)源激素在灰氈毛忍冬愈傷組織和不定芽誘導(dǎo)過(guò)程中的作用不同。低濃度的內(nèi)源GA3、IAA、ZR、ABA有利于愈傷組織的誘導(dǎo)，而高濃度的內(nèi)源GA3、IAA、ZR促進(jìn)了愈傷組織的生長(zhǎng)。不定芽誘導(dǎo)主要受內(nèi)源IAA和ABA調(diào)控，低水平的內(nèi)源IAA、ABA、ZR、GA3含量有助于愈傷組織分化成不定芽。
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13、5)灰氈毛忍冬新品種組織培養(yǎng)過(guò)程多胺變化的研究。以金翠蕾組培苗為試驗(yàn)材料，分析了組培苗增殖分化、生根過(guò)程的內(nèi)源多胺含量變化，研究了6-BA濃度對(duì)繼代培養(yǎng)組培苗、IBA濃度對(duì)生根培養(yǎng)組培苗內(nèi)源多胺含量的影響。結(jié)果表明：①不同的內(nèi)源多胺在灰氈毛忍冬組培苗增殖分化過(guò)程中有不同效應(yīng)。組培苗增殖分化主要與Spd、Put含量和Put/Spm值關(guān)系密切，與Spm含量和Put/Spd值、Put/(Spd+Spm)值關(guān)系不大；高水平的Spd、Put含量和

14、Put/Spm值有利于組培苗增殖分化的啟動(dòng)，而增殖分化盛期則需要維持較低水平的Put、Spd含量和Put/Spm值。②Put、Spd、Spm及其平衡關(guān)系在灰氈毛忍冬組培苗根原基的分化形成與生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的作用各異。高水平的Put、Spm含量和Put/Spd值、Put/(Spd+Spm)值有利于組培苗根原基的分化形成，而低水平的Put、Spm含量和Put/Spd值、Put/(Spd+Spm)值則促進(jìn)根原基的生長(zhǎng)發(fā)育。低水平的Spd含量和P