具胃毒殺蟲活性的球孢白僵菌工程菌劑對甘藍害蟲的整季田間防效和安全性評價.pdf

1、基于活體細胞的真菌殺蟲菌劑時效性較差，限制其商業(yè)開發(fā)和應(yīng)用。生防真菌轉(zhuǎn)基因工程菌劑在很大程度能克服殺蟲時效性較差的缺點，但繞不開環(huán)境安全性的公眾疑慮，而目前缺乏轉(zhuǎn)基因真菌殺蟲劑田間殺蟲效果和安全性評價的實例。本研究以先前構(gòu)建的超高表達蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)殺蟲蛋白Vip3Aal而對鱗翅目害蟲表現(xiàn)高胃毒殺蟲活性的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)工程菌株BbHV8及其親本野生株Bb2

2、860(簡稱WT)為材料，將其高純度分生孢子粉配制成孢子懸乳劑(emulsifiable formulation)，在浙江金華從初夏開始進行了兩個獨立的各歷時35天防治以菜青蟲(Pieris rapae)為主、小菜蛾(Plutella xylostella)和桃蚜(Myzuspersicae)為輔的田間試驗，一是比較兩種菌劑與當家化學殺蟲劑甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽（簡稱甲維鹽）在根據(jù)蟲情四次用菌用藥條件下對卷心甘藍的整季保護效果;二是在試

3、驗期間評價了各處理對田間捕食性天敵蜘蛛種群的影響，試驗之后數(shù)月期間多批次采樣評價兩種菌劑在釋放環(huán)境中的存留狀況、環(huán)境適應(yīng)性及其對土壤真菌群落的影響，作為其環(huán)境安全性的評判依據(jù)。在此基礎(chǔ)上，探索了利用工程菌中靶基因的引物在實時定量熒光PCR中的特異性，通過制定標準曲線快速定量檢測甘藍葉片上和環(huán)境土壤樣品中工程菌含量的可能性，為工程菌劑的環(huán)境安全性評價和管控提供技術(shù)參考。主要結(jié)果摘要如下:
　　 工程菌劑BbHV8對甘藍的整季保護效

4、果與甲維鹽匹敵在夏季由水稻和玉米作物包圍的兩地塊中分別于4月2日和12日移載的甘藍，很快誘集菜粉蝶等鱗翅目害蟲前來產(chǎn)卵，田間菜青蟲分別于4月22日和5月5日達到0.94±0.06和0.93±0.05頭/株甘藍(mean±SEM)的蟲口密度，大大超過0.5頭/株的經(jīng)濟危害閾值，故作為試驗1和試驗2用菌用藥處理的起始日。兩試驗均包括4個處理，即BbHV8和WT的懸乳劑(1010個孢子/mL)100倍稀釋液機動彌霧（用菌量均為1013個孢子/

5、公頃）、5％甲維鹽水分散粒劑按標簽用量機動彌霧（標準化防）及配制孢子懸乳劑的乳油100倍稀釋液機動彌霧（空白對照），每處理4個小區(qū)(6×11 m)，隨機區(qū)組排列。試驗1首次彌霧后間隔10天重復(fù)用菌用藥，每隔5天抽樣調(diào)查各處理中菜青蟲、小菜蛾及蚜蟲密度，第25天對照中菜青蟲蟲口達16.1±1.0頭/株，而BbHV8、WT及甲維鹽處理中分別為4.3±0.3、8.2±0.8和1.3±0.2頭/株;首次藥后20天，在BbHV8、WT、甲維鹽和對

6、照中小菜蛾蟲口分別0.40±0.08、0.45±0.06、0.75±0.06及1.50±0.15頭/株，第35天分別為0.15±0.05、0.28±0.09、1.95±0.64及0.13±0.05頭/株。試驗1中桃蚜初始密度為12.7±1.1頭/株，首次藥后15天甲維鹽處理區(qū)蚜蟲數(shù)量上升，第35天68.6±3.2頭/株，而同期BbHV8處理區(qū)僅為10.9±1.5頭/株。試驗2的蟲情與試驗1相近，但對照處理菜青蟲密度于第10天高達27.7

7、±2.0頭/株，于是分別在首次藥后第5天和第15天重復(fù)用菌用藥，最終試驗2各處理的控蟲效果優(yōu)于試驗1。
　　 由于兩試驗中都是暴食性菜青蟲主導(dǎo)危害甘藍，對照葉片損毀十分嚴重，且被損毀植株上的菜青蟲就近轉(zhuǎn)移到可取食的植株，使田間抽樣調(diào)查的蟲口數(shù)難以真實反映甘藍受害狀況，故調(diào)查時根據(jù)每株甘藍葉片損失率分為5級，作為各處理相對防效和綜合保護效果的評價依據(jù)。結(jié)果表明，試驗1中BbHV8、WT和甲維鹽歷次抽樣調(diào)查的相對防效分別為65～75

8、％、15～58％和42～85％，平均防效分別為70.5％(±1.2)、30.9％(±6.1)和69.7％(±6.9)。試驗2期間上述三處理的相對防效波動范圍分別為49～80％、41～70％和51～90％，平均防效分別為74.5％(±4.3)、48.4％(±4.2)和83.5％(±5.5)。兩個試驗中，工程菌劑BbHV8與甲維鹽的總體防效相似或相近，都顯著高于WT。后者對害蟲有一定的控制作用，但當菜青蟲暴發(fā)時，難以及時控制蟲口數(shù)量而對甘藍

9、予以有效保護。
　　 在試驗2期間補充進行了兩種菌劑相同用菌量下對暴食性4齡菜青蟲的田間生物測定，測得BbHV8對4齡菜青蟲的LT5o和LT95分別為1.6(1.2～1.9)和4.5(4.3～4.8)天，而WT的LT5o和LT95分別為5.7(5.4～6.0)和11.5(10.6～12.8)天。這一結(jié)果說明， BbHV8毒殺4齡菜青蟲50％和95％比WT分別快4天和7天。
　　 工程菌劑BbHV8的生態(tài)安全性在田間試驗1

10、和2期間的歷次抽樣調(diào)查中，BbHV8和WT菌劑處理對田間蜘蛛種群均未見負面影響，BbHV8由于較好保護了甘藍，對田間蜘蛛種群有所助增，而甲維鹽處理區(qū)蜘蛛數(shù)量一直低于菌劑處理區(qū)。
　　 在試驗1最后一次用菌后次日、30天內(nèi)每隔10天、半年內(nèi)每隔一個月采集用菌和對照處理小區(qū)的表層土壤(0-5 cm)，帶回實驗室分別選擇性分離培養(yǎng)球孢白僵菌與腐生絲狀真菌并統(tǒng)計每克土樣中的菌落形成單位(CFU)數(shù)量。結(jié)果顯示，WT和BbHV8小區(qū)噴菌后

11、次日每克土壤（干重）中球孢白僵菌CFU含量分別達3.1(±0.4)×104和2.1(±0.4)×104個，10天后降為4.3(±0.2)×103和3.2(±0.2)×103個，20天后降為3.8(±0.7)×102和4.1(±0.8)×102個，此后低水平徘徊，第120天后分別降至145±59和36±36個，再往后采集的土樣中再未分離到球孢白僵菌。對照小區(qū)中僅在用菌后第20和30天的每克土樣中分離到69±40和34±34個CFU，顯示田

12、間雨水等因素可導(dǎo)致白僵菌在地塊內(nèi)的輕微擴散。各批次土樣中分離培養(yǎng)的腐生真菌CFU數(shù)量雖有季節(jié)性變化，但同批次樣品中的CFU含量在兩菌劑與對照處理間均無顯著差異。
　　 將用菌后30天、60天和90天的球孢白僵菌土壤分離物各選24株共72株，每次來自BbHV8和WT小區(qū)的各12株，通過PCR檢測它們是否攜帶殺蟲蛋白基因vip3Aa1基因。結(jié)果顯示，來自用菌后30天WT小區(qū)的12株菌有2株呈陽性，而源于BbHV8小區(qū)的12株菌中也有

13、2株呈陰性;用菌后60天的分離物鑒定結(jié)果，來自WT處理小區(qū)的白僵菌全為陰性，來自BbHV8小區(qū)的僅有1株呈陰性;用菌后90天的土樣分離株中，來自BbHV8小區(qū)的全為陽性，而來自WT小區(qū)的全為陰性。顯然，所用菌劑由于雨水涇流等原因在地塊內(nèi)存在擴散或相互串染的現(xiàn)象，但串染率不超過17％，且隨著田間存留量的減少，串染比率降低，最后消失。
　　 用菌后90天BbHV8和WT小區(qū)的土壤分離株rHV8和rWT在SDAY平板上培養(yǎng)8天的產(chǎn)孢量

14、分別比BbHV8和WT下降26.5％和32.4％，而且rHV8培養(yǎng)8天的菌落直徑比BbHV8小32.2％; rWT雖比WT生長快9.1％，但菌落產(chǎn)孢量大幅下降。環(huán)境脅迫試驗表明，BbHV8分生孢子耐UV-B輻射和45℃高溫的能力分別比WT低19.2％和12.5％，rHV8比BbHV8分別低32.5％和38.9％，rWT比WT分別低39.7％和31.0％?？傮w看，BbHV8和Bb2860在釋放環(huán)境中的生態(tài)適應(yīng)能力呈下降趨勢，且前者的生態(tài)適

15、應(yīng)能力弱于后者。
　　 工程菌劑BbHV8在釋放環(huán)境中存留量的快速定量檢測技術(shù)探索通過實時熒光定量PCR擴增融解曲線對靶基因vip3Aa1引物特異性的分析建立擴增標準曲線，利用靶基因在BbHV8細胞中單拷貝的特性，以含分生孢子的甘藍葉片和土壤樣品的總DNA提取物為模板，探索建立甘藍和土壤樣品中孢子含量的快速檢測方法。結(jié)果顯示，菜葉上孢子的檢測精度可達2個孢子/mm2，土壤中也可檢出1～2個孢子/mg干土。然而，土壤成份復(fù)雜，影響