蘇云金芽孢桿菌殺蟲基因的克隆和殺蟲假單胞工程菌的構(gòu)建.pdf

1、由于蘇云金桿菌在使用過程中存在的一些不足及害蟲對其抗藥性的產(chǎn)生，人們逐漸轉(zhuǎn)向利用生物技術(shù)將Bt的殺蟲基因轉(zhuǎn)入其它更有優(yōu)勢的微生物中。本研究從本實驗室分離的野生型蘇云金芽孢桿菌中克隆有特異殺蟲活性的vip3A基因和cry1Ba基因，并將其轉(zhuǎn)入到植物根際有益微生物中，構(gòu)建殺蟲防病的工程菌。 利用PCR-RFLP方法對本實驗室分離的蘇云金芽孢桿菌WZ-7和sfw12菌株進行了基因型鑒定。鑒定結(jié)果表明，WZ-7中含有cry1Ab和vi

2、p3A，sfw12中含有cry1Ba基因。 根據(jù)vip3A和cry1Ba的基因序列分別設(shè)計引物，利用PCR方法從本實驗室分離的蘇云金芽孢桿菌WZ-7和sfw12菌株中擴增得到vip3A-WZ7全長序列及cry1Ba-sfw12片段。將PCR產(chǎn)物連入T-載體并測序，得到的vip3A-WZ7基因序列翻譯為Vip3A-WBS蛋白一級序列，利用NCBI在線的Blast軟件進行同源性分析。結(jié)果表明，該蛋白與已報道的10余個Vip3A蛋白

3、同源性達99﹪以上，與其它蛋白無同源性。同樣方法證實Cry1Ba-sfw12與Cry1Ba蛋白的同源性達99﹪。 將克隆的vip3A-WZ7基因插入攜帶Tn5轉(zhuǎn)座子的pAG408自殺性質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌S17-1(λp)，通過接合轉(zhuǎn)移，將vip3A基因整合到假單胞菌染色體上，根據(jù)發(fā)光強度，并結(jié)合生物測定，挑選出殺蟲活性高的Pshvip9接合子，PCR鑒定表明vip3A基因已經(jīng)插入假單胞菌染色體。生物測定結(jié)果表明，工程菌

4、Pshvip9對棉鈴蟲及甜菜夜蛾有較好的胃毒活性，LC50分別為1.02×108cells/mL和6.95×107cells/mL。 室內(nèi)平板抑菌實驗表明，其對黃瓜枯萎病菌和小麥根腐病菌及大腸桿菌和Bt等有較強的抑菌作用，與出發(fā)菌株差別不大。對工程菌生長曲線的測定表明18h左右就可達到穩(wěn)定期。對該工程菌同時在滅菌土和自然土中進行了小麥根部定殖試驗，結(jié)果表明，在20天左右時能達到3～4×106CFU/g土壤。以上結(jié)果表明，將vi