蘇云金芽孢桿菌殺蟲(chóng)基因的克隆和殺蟲(chóng)假單胞工程菌的構(gòu)建.pdf

1、由于蘇云金桿菌在使用過(guò)程中存在的一些不足及害蟲(chóng)對(duì)其抗藥性的產(chǎn)生，人們逐漸轉(zhuǎn)向利用生物技術(shù)將Bt的殺蟲(chóng)基因轉(zhuǎn)入其它更有優(yōu)勢(shì)的微生物中。本研究從本實(shí)驗(yàn)室分離的野生型蘇云金芽孢桿菌中克隆有特異殺蟲(chóng)活性的vip3A基因和cry1Ba基因，并將其轉(zhuǎn)入到植物根際有益微生物中，構(gòu)建殺蟲(chóng)防病的工程菌。 利用PCR-RFLP方法對(duì)本實(shí)驗(yàn)室分離的蘇云金芽孢桿菌WZ-7和sfw12菌株進(jìn)行了基因型鑒定。鑒定結(jié)果表明，WZ-7中含有cry1Ab和vi

2、p3A，sfw12中含有cry1Ba基因。 根據(jù)vip3A和cry1Ba的基因序列分別設(shè)計(jì)引物，利用PCR方法從本實(shí)驗(yàn)室分離的蘇云金芽孢桿菌WZ-7和sfw12菌株中擴(kuò)增得到vip3A-WZ7全長(zhǎng)序列及cry1Ba-sfw12片段。將PCR產(chǎn)物連入T-載體并測(cè)序，得到的vip3A-WZ7基因序列翻譯為Vip3A-WBS蛋白一級(jí)序列，利用NCBI在線的Blast軟件進(jìn)行同源性分析。結(jié)果表明，該蛋白與已報(bào)道的10余個(gè)Vip3A蛋白

3、同源性達(dá)99﹪以上，與其它蛋白無(wú)同源性。同樣方法證實(shí)Cry1Ba-sfw12與Cry1Ba蛋白的同源性達(dá)99﹪。 將克隆的vip3A-WZ7基因插入攜帶Tn5轉(zhuǎn)座子的pAG408自殺性質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌S17-1(λp)，通過(guò)接合轉(zhuǎn)移，將vip3A基因整合到假單胞菌染色體上，根據(jù)發(fā)光強(qiáng)度，并結(jié)合生物測(cè)定，挑選出殺蟲(chóng)活性高的Pshvip9接合子，PCR鑒定表明vip3A基因已經(jīng)插入假單胞菌染色體。生物測(cè)定結(jié)果表明，工程菌

4、Pshvip9對(duì)棉鈴蟲(chóng)及甜菜夜蛾有較好的胃毒活性，LC50分別為1.02×108cells/mL和6.95×107cells/mL。 室內(nèi)平板抑菌實(shí)驗(yàn)表明，其對(duì)黃瓜枯萎病菌和小麥根腐病菌及大腸桿菌和Bt等有較強(qiáng)的抑菌作用，與出發(fā)菌株差別不大。對(duì)工程菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定表明18h左右就可達(dá)到穩(wěn)定期。對(duì)該工程菌同時(shí)在滅菌土和自然土中進(jìn)行了小麥根部定殖試驗(yàn)，結(jié)果表明，在20天左右時(shí)能達(dá)到3～4×106CFU/g土壤。以上結(jié)果表明，將vi