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文檔簡介
1、促卵泡激素是由動物垂體前葉嗜堿性細(xì)胞合成并分泌的一種糖蛋白激素,由α和β亞基組成,而β亞基是激素生物活性和免疫活性的決定因素。促卵泡激素β亞單位由FSHβ基因編碼,前人的研究表明,F(xiàn)SHβ基因多態(tài)性與動物多產(chǎn)性有密切關(guān)聯(lián)性,該基因是影響動物產(chǎn)仔數(shù)的主效基因之一。本研究以新西蘭白兔為研究對象,采用基因克隆、原核表達(dá)和Real-time PCR等方法研究家兔FSHβ基因的在原核表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)情況,制備抗家兔FSHβ多克隆抗體,并對FSHβ
2、基因在家兔卵巢、輸卵管、子宮、睪丸和輸精管等生殖器官中的表達(dá)差異進(jìn)行了分析。主要結(jié)果如下:
1.本研究參考GenBank數(shù)據(jù)庫中日本大耳兔FSHβ基因的mRNA序列設(shè)計了一對引物,對新西蘭白兔FSHβ基因進(jìn)行克隆、序列分析,并將其與其它物種的FSHβ基因CDS序列和編碼氨基酸序列進(jìn)行同源性比較。結(jié)果表明,克隆得到的CDS序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列完全一致,核苷酸序列與其它哺乳動物的同源性較高(86.4%~89.7%),
3、但與禽類、魚類的同源性較低,分別為74.1%和53.3%?;贔SHβ基因序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析,可知家兔與人、黑猩猩的親緣關(guān)系較近,聚類分析結(jié)果與生物學(xué)分類結(jié)果基本一致。
2.PCR擴(kuò)增FSHβ基因去信號肽序列,并成功構(gòu)建了去信號肽FSHβ基因的原核表達(dá)載體pGEX-4T-1-FSHβ,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)、超聲波破碎菌體、SDS-PAGE凝膠電泳檢測,得到大小約為42kDa的融合蛋白,而且重組表達(dá)質(zhì)粒在大腸桿菌BL21(DE3
4、)中的表達(dá)產(chǎn)物主要是以包涵體形式存在的,將得到的包涵體融合蛋白純化后免疫小鼠,分離小鼠血清,得到FSHβ多克隆抗體,對多克隆抗體進(jìn)行ELISA和Western Blot檢測,結(jié)果表明抗體的效價為1∶256000,特異性較好。
3.對FSHβ基因在9~23周齡家兔的卵巢、輸卵管、子宮、睪丸和輸精管等生殖器官中的表達(dá)水平進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測。結(jié)果表明,F(xiàn)SHβ基因在5個生殖器官中均有表達(dá),13周齡各組織間表達(dá)量差異不顯著(P
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