重組人促卵泡激素檢定用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研究.pdf

1、人促卵泡激素(human follicle stimulating hormone，hFSH)是垂體前葉嗜堿性細(xì)胞合成和分泌的一種糖蛋白類(lèi)促性腺激素。作為藥物，廣泛用于治療垂體功能低下的不孕不育，和人類(lèi)輔助生殖技術(shù)。近幾年隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，重組型人促卵泡激素以高純度、無(wú)毒副作用的優(yōu)點(diǎn)漸漸替代天然提取型，已大量用于臨床治療。鑒于此種情況，對(duì)此類(lèi)藥物制定嚴(yán)格的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)是非常必要的。但是，國(guó)外現(xiàn)僅有重組人促卵泡激素國(guó)際生物標(biāo)準(zhǔn)品未有

2、重組人促卵泡激素國(guó)際理化對(duì)照品；我國(guó)也還沒(méi)有重組人促卵泡激素的國(guó)家對(duì)照品和標(biāo)準(zhǔn)品。本實(shí)驗(yàn)的目的是通過(guò)對(duì)重組人促卵泡激素（rhFSH）的結(jié)構(gòu)確證，質(zhì)量研究及實(shí)驗(yàn)方法學(xué)的優(yōu)化進(jìn)行了較為全面系統(tǒng)的研究。為建立我國(guó)國(guó)家重組人促卵泡激素（rhFSH）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及理化對(duì)照品奠定了基礎(chǔ)，并完善了重組人促卵泡激素（rhFSH）質(zhì)控技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。
　　本實(shí)驗(yàn)首先進(jìn)行了重組人促卵泡激素(rhFSH)結(jié)構(gòu)確證部分的研究分析。三種不同方法測(cè)定分子量，SDS－P

3、AGE測(cè)定表觀分子量為43KD，SEC-HPLC法測(cè)量分子量大約在43KD和!3.7KD之間，MALDI-TOF測(cè)的結(jié)果兩個(gè)亞基分別為14.2KD和17.4KD，rhFSH分子量為31.6KD，與文獻(xiàn)報(bào)道(31KD)一致。同時(shí)從紫外光譜分析，測(cè)得rhFSH最大吸收波長(zhǎng)在276.6nm處。等電聚焦分析rhFSH樣品范圍在3.5～5.5之間。免疫鑒別印跡結(jié)果rhFSH對(duì)照品和rhFSH樣品均為陽(yáng)性，而rhCG樣品免疫印跡鑒別結(jié)果為陰性。再結(jié)

4、合肽圖分析等幾個(gè)方面進(jìn)行對(duì)上述實(shí)驗(yàn)的分析，對(duì)重組人促卵泡激素(rhFSH)結(jié)構(gòu)得到了基本確證。
　　接著進(jìn)行了重組人促卵泡激素(rhFSH)原液質(zhì)量部分的研究。使用Lowry法測(cè)定蛋白濃度為0.876mg/ml。用非還原 SDS－PAGE檢測(cè)解離亞基小于5％。利用SDS-PAGE(銀染)檢測(cè)聚合體的含量小于2％。使用Wister大鼠測(cè)量 rhFSH生物活性：測(cè)得效價(jià) PT=8087.5IU/mL,效價(jià)的可信限率為FL=21.014

5、%,效價(jià)的可信限范圍為6548.1～9947.1IU/mL。結(jié)合數(shù)據(jù)，基本對(duì)rhFSH原液質(zhì)量部分進(jìn)行確認(rèn)。
　　在實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，對(duì)重組人促卵泡激素(rhFSH)的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了部分方法學(xué)的研究與優(yōu)化。rhFSH切糖試驗(yàn)中，經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)和對(duì)比，增加了一步中高溫加熱反應(yīng)，優(yōu)化了還原條件，使切糖試驗(yàn)結(jié)果更穩(wěn)定，效果更明顯。并比較自研方法和傳統(tǒng)試劑盒的切糖結(jié)果，證明前者切除 rhFSH的糖鏈適宜，而后者對(duì)于切除rhFSH的糖鏈不太適宜。，優(yōu)