急性病毒性壞死病毒引物酶基因克隆、表達(dá)及相關(guān)功能分析.pdf

1、櫛孔扇貝（Chlamys farreri）是我國(guó)北方沿海重要的優(yōu)良養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)貝類之一，其規(guī)模化養(yǎng)殖已有30多年，給我國(guó)山東半島和遼東半島等沿海地區(qū)帶來(lái)了可觀的經(jīng)濟(jì)效益，1990年以來(lái)，我國(guó)北方養(yǎng)殖海區(qū)連年暴發(fā)櫛孔扇貝大規(guī)模死亡（死亡率在90％以上），從而使櫛孔扇貝養(yǎng)殖業(yè)蒙受巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重影響了貝類產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。多年研究發(fā)現(xiàn)，引發(fā)我國(guó)北方養(yǎng)殖海區(qū)櫛孔扇貝夏季大規(guī)模死亡的病原就是急性病毒性壞死病毒（acute viral necro

2、sis virus，AVNV），此病毒是呈球形的雙鏈DNA病毒，它主要分布于扇貝外套膜、消化腺、腸和腎臟間質(zhì)組織細(xì)胞和結(jié)締組織細(xì)胞中，任偉成等完成了AVNV全基因組測(cè)序，在AVNV全基因組預(yù)測(cè)的潛在開(kāi)放閱讀框（open reading frames，ORF）中，發(fā)現(xiàn)與AVNV的DNA復(fù)制、核酸修飾與代謝及病毒與宿主相互作用相關(guān)的ORF有44個(gè)。其中ORF024編碼的引物酶基因參與病毒DNA復(fù)制。引物酶（primase）是一種存在于生物及

3、病毒體內(nèi)的RNA聚合酶，它與DNA的復(fù)制和病毒活性密切相關(guān)。為確定ORF024能否編碼特定的、具有功能的引物酶，以及編碼的引物酶是否在AVNV中感染、復(fù)制以及在急性病毒性壞死癥（acute viral necrosis Disease，AVND）暴發(fā)中發(fā)揮作用，作者根據(jù)AVNV引物酶基因設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增AVNV引物酶ORF024，并構(gòu)建引物酶基因的原核表達(dá)載體，在E.coli中進(jìn)行原核表達(dá)、純化并對(duì)重組引物酶進(jìn)行酶學(xué)活性分析。然后

4、利用綠茶提取物（茶多酚）對(duì)AVNV引物酶的抑制作用，來(lái)探討茶多酚抗病毒的作用機(jī)理。此外，利用AVNV感染櫛孔扇貝，通過(guò)相對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析不同組織在不同時(shí)間的引物酶基因表達(dá)情況，在 mRNA水平上進(jìn)行轉(zhuǎn)錄與時(shí)序表達(dá)分析，探討AVNV引物酶基因?qū)VNV在扇貝體內(nèi)復(fù)制的影響，同時(shí)在AVNV病毒提取液中加入茶多酚再進(jìn)行感染櫛孔扇貝，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量 PCR分析不同組織在不同時(shí)間的引物酶基因表達(dá)，探討茶多酚對(duì)AVNV在扇貝體內(nèi)復(fù)制的抑制

5、及其抑制效率，從而為茶多酚可能的抗AVNV作用機(jī)理提供理論依據(jù)。
　　1．AVNV引物酶基因的克隆及原核表達(dá)。根據(jù)AVNV基因組序列，設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增編碼AVNV引物酶的ORF024，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳得到一條約1050 bp大小的條帶，雙酶切后將其連接至 pET32a中構(gòu)建重組原核表達(dá)載體pET32a-prim，并將其轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞BL21（DE3）中，加 IPTG至終濃度1mmol/L，誘導(dǎo)4-5小時(shí)后，SDS-PAG

6、E電泳得到一條約60 KDa的條帶，經(jīng)Western-blotting及質(zhì)譜分析確定為重組引物酶。
　　2．重組引物酶的純化及酶學(xué)活性分析。利用Co2+親和層析柱對(duì)表達(dá)的重組引物酶進(jìn)行純化，并測(cè)定純化的重組引物酶的活性、底物特異性、不同金屬離子及EDTA對(duì)其活性的影響。結(jié)果表明：在以poly（d C）為單鏈模板時(shí)，重組引物酶對(duì)隨機(jī)引物的合成具有一定的催化活性；AVNV引物酶具有較強(qiáng)的底物特異性，能特異性催化GTP水解；Zn2+、N

7、a+、K+和Mg2+這四種金屬離子對(duì)重組引物酶的催化活性具有促進(jìn)作用，Zn2+濃度為0.1 mmol/L時(shí)促進(jìn)率為5%，Na+濃度為5 mmol/L促進(jìn)率只為3%。而Mn2+對(duì)重組引物酶的催化活性具有明顯抑制作用；EDTA對(duì)重組引物酶的催化活性具有抑制作用，濃度越高，抑制率越強(qiáng)，EDTA濃度為10 mmol/L時(shí)，抑制率達(dá)12.20%。
　　3．利用在引物合成反應(yīng)體系中加入不同濃度的茶多酚溶液，探討茶多酚對(duì)體外重組引物酶活性和引物

8、合成的影響，在茶多酚7.81μg/ml、31.25μg/ml和125μg/ml的濃度作用結(jié)果如下：引物酶活性抑制率隨茶多酚濃度升高而逐漸增加，濃度125μg/ml時(shí)的抑制率達(dá)15.03%；引物合成的量隨茶多酚濃度升高而逐漸增加，濃度125μg/ml時(shí)的促進(jìn)率達(dá)11.79%。
　　4．通過(guò) AVNV病毒粗提液和混合茶多酚的病毒粗提液分別感染櫛孔扇貝，利用實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)進(jìn)行引物酶基因的轉(zhuǎn)錄時(shí)序分析。分別取感染 AVNV病毒和感染混合

9、茶多酚的AVNV病毒0，4，8，16，24，36，48和72 h后櫛孔扇貝的外套膜和鰓，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄，熒光定量PCR。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：AVNV引物酶基因在外套膜和鰓中的表達(dá)量分別于16和8 h達(dá)到最大值；茶多酚（7.81μg/ml）對(duì)AVNV引物酶的復(fù)制存在一定的抑制作用，在外套膜和鰓中的抑制率分別為5倍和10倍。
　　結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出以下結(jié)論：AVNV ORF024編碼的引物酶具有催化活性，不同金屬離子對(duì)引物酶活性影響存

10、在差異，如 Zn2+和Na+對(duì)引物酶活性存在促進(jìn)作用，而Mn2+和 EDTA對(duì)引物酶催在強(qiáng)烈抑制作用。同時(shí)引物酶基因是一種早期基因，AVNV病毒引物酶基因在櫛孔扇貝外套膜和鰓中的最大表達(dá)量和最大表達(dá)量的時(shí)間存在一定的差異，在外套膜中，引物酶基因在16 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值，而在鰓中為8 h。另外，用混合茶多酚的病毒粗提液進(jìn)行感染櫛孔扇貝后，AVNV引物酶基因的表達(dá)量明顯低于未混合茶多酚的病毒粗提液進(jìn)行感染櫛孔扇貝后的引物酶基因的表達(dá)量，說(shuō)