急性病毒性壞死病毒引物酶基因克隆、表達及相關(guān)功能分析.pdf

1、櫛孔扇貝（Chlamys farreri）是我國北方沿海重要的優(yōu)良養(yǎng)殖經(jīng)濟貝類之一，其規(guī)?；B(yǎng)殖已有30多年，給我國山東半島和遼東半島等沿海地區(qū)帶來了可觀的經(jīng)濟效益，1990年以來，我國北方養(yǎng)殖海區(qū)連年暴發(fā)櫛孔扇貝大規(guī)模死亡（死亡率在90％以上），從而使櫛孔扇貝養(yǎng)殖業(yè)蒙受巨大的經(jīng)濟損失，嚴(yán)重影響了貝類產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。多年研究發(fā)現(xiàn)，引發(fā)我國北方養(yǎng)殖海區(qū)櫛孔扇貝夏季大規(guī)模死亡的病原就是急性病毒性壞死病毒（acute viral necro

2、sis virus，AVNV），此病毒是呈球形的雙鏈DNA病毒，它主要分布于扇貝外套膜、消化腺、腸和腎臟間質(zhì)組織細(xì)胞和結(jié)締組織細(xì)胞中，任偉成等完成了AVNV全基因組測序，在AVNV全基因組預(yù)測的潛在開放閱讀框（open reading frames，ORF）中，發(fā)現(xiàn)與AVNV的DNA復(fù)制、核酸修飾與代謝及病毒與宿主相互作用相關(guān)的ORF有44個。其中ORF024編碼的引物酶基因參與病毒DNA復(fù)制。引物酶（primase）是一種存在于生物及

3、病毒體內(nèi)的RNA聚合酶，它與DNA的復(fù)制和病毒活性密切相關(guān)。為確定ORF024能否編碼特定的、具有功能的引物酶，以及編碼的引物酶是否在AVNV中感染、復(fù)制以及在急性病毒性壞死癥（acute viral necrosis Disease，AVND）暴發(fā)中發(fā)揮作用，作者根據(jù)AVNV引物酶基因設(shè)計特異性引物進行擴增AVNV引物酶ORF024，并構(gòu)建引物酶基因的原核表達載體，在E.coli中進行原核表達、純化并對重組引物酶進行酶學(xué)活性分析。然后

4、利用綠茶提取物（茶多酚）對AVNV引物酶的抑制作用，來探討茶多酚抗病毒的作用機理。此外，利用AVNV感染櫛孔扇貝，通過相對實時熒光定量PCR分析不同組織在不同時間的引物酶基因表達情況，在 mRNA水平上進行轉(zhuǎn)錄與時序表達分析，探討AVNV引物酶基因?qū)VNV在扇貝體內(nèi)復(fù)制的影響，同時在AVNV病毒提取液中加入茶多酚再進行感染櫛孔扇貝，通過實時熒光定量 PCR分析不同組織在不同時間的引物酶基因表達，探討茶多酚對AVNV在扇貝體內(nèi)復(fù)制的抑制

5、及其抑制效率，從而為茶多酚可能的抗AVNV作用機理提供理論依據(jù)。
　　1．AVNV引物酶基因的克隆及原核表達。根據(jù)AVNV基因組序列，設(shè)計特異性引物，擴增編碼AVNV引物酶的ORF024，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳得到一條約1050 bp大小的條帶，雙酶切后將其連接至 pET32a中構(gòu)建重組原核表達載體pET32a-prim，并將其轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞BL21（DE3）中，加 IPTG至終濃度1mmol/L，誘導(dǎo)4-5小時后，SDS-PAG

6、E電泳得到一條約60 KDa的條帶，經(jīng)Western-blotting及質(zhì)譜分析確定為重組引物酶。
　　2．重組引物酶的純化及酶學(xué)活性分析。利用Co2+親和層析柱對表達的重組引物酶進行純化，并測定純化的重組引物酶的活性、底物特異性、不同金屬離子及EDTA對其活性的影響。結(jié)果表明：在以poly（d C）為單鏈模板時，重組引物酶對隨機引物的合成具有一定的催化活性；AVNV引物酶具有較強的底物特異性，能特異性催化GTP水解；Zn2+、N

7、a+、K+和Mg2+這四種金屬離子對重組引物酶的催化活性具有促進作用，Zn2+濃度為0.1 mmol/L時促進率為5%，Na+濃度為5 mmol/L促進率只為3%。而Mn2+對重組引物酶的催化活性具有明顯抑制作用；EDTA對重組引物酶的催化活性具有抑制作用，濃度越高，抑制率越強，EDTA濃度為10 mmol/L時，抑制率達12.20%。
　　3．利用在引物合成反應(yīng)體系中加入不同濃度的茶多酚溶液，探討茶多酚對體外重組引物酶活性和引物

8、合成的影響，在茶多酚7.81μg/ml、31.25μg/ml和125μg/ml的濃度作用結(jié)果如下：引物酶活性抑制率隨茶多酚濃度升高而逐漸增加，濃度125μg/ml時的抑制率達15.03%；引物合成的量隨茶多酚濃度升高而逐漸增加，濃度125μg/ml時的促進率達11.79%。
　　4．通過 AVNV病毒粗提液和混合茶多酚的病毒粗提液分別感染櫛孔扇貝，利用實時熒光定量技術(shù)進行引物酶基因的轉(zhuǎn)錄時序分析。分別取感染 AVNV病毒和感染混合

9、茶多酚的AVNV病毒0，4，8，16，24，36，48和72 h后櫛孔扇貝的外套膜和鰓，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄，熒光定量PCR。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：AVNV引物酶基因在外套膜和鰓中的表達量分別于16和8 h達到最大值；茶多酚（7.81μg/ml）對AVNV引物酶的復(fù)制存在一定的抑制作用，在外套膜和鰓中的抑制率分別為5倍和10倍。
　　結(jié)合本實驗結(jié)果可以得出以下結(jié)論：AVNV ORF024編碼的引物酶具有催化活性，不同金屬離子對引物酶活性影響存

10、在差異，如 Zn2+和Na+對引物酶活性存在促進作用，而Mn2+和 EDTA對引物酶催在強烈抑制作用。同時引物酶基因是一種早期基因，AVNV病毒引物酶基因在櫛孔扇貝外套膜和鰓中的最大表達量和最大表達量的時間存在一定的差異，在外套膜中，引物酶基因在16 h時表達量達到峰值，而在鰓中為8 h。另外，用混合茶多酚的病毒粗提液進行感染櫛孔扇貝后，AVNV引物酶基因的表達量明顯低于未混合茶多酚的病毒粗提液進行感染櫛孔扇貝后的引物酶基因的表達量，說