二化螟抗藥性監(jiān)測及其解毒酶基因的轉錄組分析.pdf

1、二化螟屬于鱗翅目螟蛾科，是水稻上重要的鉆鉆蛀性害蟲之一。二化螟在我國的危害范圍很廣，并且除了水稻外還可以危害茭白、甘蔗等多種作物。長期連續(xù)的使用殺蟲劑，必然會帶來抗藥性問題。水稻的水田生長環(huán)境和糧食作物的特性使得可以用于水稻害蟲防治的殺蟲劑種類有限，因此亟需高效合理的抗性治理措施以延緩現有殺蟲劑的使用壽命?？剐詸C理的深層分子機制研究可以為抗性治理措施的發(fā)展提供理論基礎。本文監(jiān)測了不同地區(qū)二化螟對幾種常見殺蟲劑的抗性，并對二化螟主要解毒代

2、謝酶基因進行了克隆和分析，還通過誘導實驗研究了二化螟解毒代謝酶基因對不同殺蟲劑的誘導響應，相關研究結果可以為二化螟抗性治理措施的發(fā)展提供理論依據。
　　1.不同地區(qū)水稻二化螟抗藥性監(jiān)測
　　利用準確可靠的方法監(jiān)測掌握害蟲田間抗藥性動態(tài)，是害蟲抗藥性治理的關鍵。本研究首先利用室內敏感品系和野外田間種群比較研究了2種螟蟲抗藥性測定方法，結果表明初孵幼蟲藥膜法方法使用簡便，監(jiān)測抗性靈敏度高，可用于二化螟的抗性監(jiān)測。其后利用初孵幼蟲

3、藥膜法測定了我國7個地理種群二化螟對氯蟲苯甲酰胺、丁烯氟蟲腈、三唑磷和丙溴磷的抗性水平，結果表明，我國多數稻區(qū)的二化螟對三唑磷和丙溴磷都產生了高水平抗性，僅有四川萬州等少數地區(qū)仍保持敏感水平;但對新藥氯蟲苯甲酰胺大都保持敏感，僅有浙江金華等極少數地區(qū)的二化螟敏感性下降，開始產生低水平抗性（9.4倍）;以室內敏感品系雖然沒有檢測出丁烯氟蟲腈的抗性，但地區(qū)種群之間差異較大，表明局部地區(qū)可能因氟蟲腈的施藥歷史存在交互抗性。第三，利用廣西地區(qū)的

4、3種螟蟲比較了6種殺蟲劑對二化螟、大螟和臺灣稻螟的毒力差異，結果表明，僅有阿維菌素和殺蟲單等少數藥劑對不同螟蟲具有相似的毒力，其余大都表現出明顯的毒力差異:氯蟲苯甲酰胺對臺灣稻螟毒力相對較差;丁烯氟蟲腈對二化螟的毒力顯著大于大螟，而醚菊酯和三唑磷對大螟的毒力顯著高于二化螟，這三種藥劑對臺灣稻螟的毒力均位于二化螟和大螟之間。討論認為目前防治水稻螟蟲應該限制使用有機磷等已經產生較高水平抗性的老農藥品種，新藥使用首先應注意抗藥性治理，延緩抗性

5、發(fā)展，尤其是高抗地區(qū)，其次是應該針對當地的螟蟲優(yōu)勢種選擇藥劑，進行針對性藥劑防治。
　　2.二化螟P450基因的轉錄組分析
　　研究昆蟲全基因組CYP基因有利于弄清參與特定生理生化功能的P450基因，進而可以開發(fā)新型害蟲防控技術，以及抗藥性精準監(jiān)控技術。本研究利用轉錄組和基因組數據進行二化螟的全基因組CYP基因研究，共發(fā)現并命名72個二化螟CYP基因，并克隆獲得其中25個基因的全長編碼序列。序列分析顯示二化螟CYP基因的編碼

6、區(qū)約含1500bp的核苷酸，編碼500個氨基酸左右。72個CYP基因分屬于4個集團、26個家族和37個亞家族，通過構建二化螟、家蠶、蜜蜂和果蠅共261個P450氨基酸序列的進化樹，證實了這些基因與昆蟲，尤其是鱗翅目昆蟲相應CYP基因的親緣關系。通過脊椎動物門和無脊椎動物門的22個物種中CYP基因在4個集團之間的分配比較，不僅發(fā)現CYP3基因集團在昆蟲綱的物種中存在明顯的擴增，還發(fā)現二化螟CYP6AB亞家族也存在明顯的擴增，且可能與二化螟

7、降解寄主次生代謝物質相關。此外，本研究還在二化螟CYP基因中首次發(fā)現新的CYP321F亞家族，由4個無內含子的基因組成，且可能與二化螟的抗藥性相關。利用已在其他昆蟲中報道的31個抗性相關基因在二化螟的CYP基因中查找到10個同源基因，為二化螟抗藥性的深入研究奠定了扎實基礎。
　　3.二化螟中EST和GST基因的轉錄組分析
　　酯酶(EST)和谷胱甘肽S-轉移酶(GST)和P450細胞色素多功能氧化酶都是昆蟲重要的解毒代謝酶。

8、本研究在已有工作的基礎上，綜合利用二化螟的轉錄組和基因組數據，搜索驗證獲得了27條GST基因和17條新的的EST基因，使二化螟EST基因數達到51個，與已報道的鱗翅目昆蟲全基因組EST基因數相當。對已有大于300aa的EST基因進行進化樹分析發(fā)現，30條二化螟EST基因中有8條與家蠶EST基因有1∶1的直系同源基因，有6條與棉鈴蟲EST基因有1∶1的直系同源基因，表現出明顯的親緣和較近的適應進化關系。亞細胞定位結果顯示30條酯酶基因中有

9、15條位于細胞的細胞質中，有6條位于細胞外，4條位于內質網，4條位于線粒體，1條位于細胞內骨架。BlastX結果顯示二化螟的27條GST基因中的24條分別屬于theta、omega、epsilon、zeta、delta、sigma6個家族，3條屬于unclassified，它們與其他鱗翅目昆蟲GST具有最高的相似度。本研究為進一步深入研究二化螟EST和GST基因家族中各基因的具體功能奠定了基礎。
　　4.二化螟解毒酶基因對不同殺蟲

10、劑的誘導響應
　　外源化合物可以誘導昆蟲體內的代謝酶，本研究通過亞致死劑量處理二化螟，分析了氯蟲苯甲酰胺、阿維菌素和三唑磷對二化螟P450、EST和GST基因的誘導效應。結果表明阿維菌素誘導后二化螟中11個P450基因、8個EST基因和5個GST基因表達量出現了上調，氯蟲苯甲酰胺誘導后有9個P450基因、11個EST基因和3個GST基因的表達量上升，而三唑磷誘導后有19個P450基因、8個EST基因和4個GST基因的表達量出現上調