水稻苗期黃綠葉基因YGL2的功能研究和堊白粒率QTL qPGWC-7候選基因的功能初步分析.pdf

1、本論文包括兩部分研究內(nèi)容，第一部分為水稻苗期黃綠葉基因YGL2(YELLOW-GREENLEAF2)的圖位克隆和功能分析，第二部分為水稻堊白粒率QTLqPGWC-7的精細定位和候選基因的功能初步分析。
　　第一部分:在高等植物中，血紅素加氧酶(HemeOxygenase，HO)是血紅素分解代謝的限速酶，它能夠催化血紅素的降解，從而合成光敏色素前體。之前已經(jīng)有研究報道了水稻中血紅素加氧酶在控制光周期，調(diào)節(jié)水稻開花中的作用。但是，其在

2、調(diào)節(jié)水稻葉綠素合成中的作用仍然沒有研究。本文中，我們從60Co輻射誘變的岡46B突變體中發(fā)現(xiàn)了一個苗期表現(xiàn)為黃綠葉的突變體，命名為ygl2。在自然條件下，大田中生長的ygl2突變體在苗期，葉片呈現(xiàn)黃綠色表型，3葉期時突變體黃化表型最為明顯;隨著植株的生長，突變體褪綠葉片逐漸轉(zhuǎn)綠，到抽穗期基本恢復(fù)到野生型的正常綠葉表型。通過測定葉綠素的含量發(fā)現(xiàn)，三葉期突變體中葉綠素(Chl)和類胡蘿卜素的含量顯著降低，而葉綠素a/葉綠素b的比例明顯增加，

3、隨著植株的生長，這種差異逐漸縮小。對葉片葉綠體的掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)突變體中葉綠體基粒填充不完整，每個類囊體片層的數(shù)目顯著減少，導(dǎo)致葉片中葉綠體發(fā)育不完全，因此葉片出現(xiàn)黃化表型。為研究引起葉片黃化的突變基因，我們構(gòu)建了ygl2和日本晴的F2群體，遺傳分析表明黃葉表型是由一個單隱性基因控制，利用圖位克隆的方法將該基因定位在水稻第6染色體短臂兩Indel標(biāo)記In44和In39之間約66.8kb的區(qū)間內(nèi)。測序分析發(fā)現(xiàn)，在該區(qū)間內(nèi)的一個編碼血紅素加

4、氧酶的基因的第1外顯子插入了約7kb的片段，導(dǎo)致突變體中編碼的氨基酸的改變并且引起該基因的表達量顯著下降;轉(zhuǎn)基因互補實驗和RNAi結(jié)果均表明該基因的突變導(dǎo)致了黃葉表型的產(chǎn)生;系統(tǒng)進化樹分析表明該基因編碼的蛋白屬于血紅素加氧酶1亞家族，該基因的突變使蛋白的二級和三級結(jié)構(gòu)發(fā)生了輕微改變，但是水稻原生質(zhì)體亞細胞定位發(fā)現(xiàn)ygl2中該基因的突變并沒有影響其編碼蛋白在細胞葉綠體中的定位;GUS染色和qRT-PCR分析表明該基因在水稻各組織中組成型表

5、達，但是在葉片中的表達量最高，并且苗期該基因的表達量高于分蘗期;不同溫度處理后，YGL2基因的表達受到影響并且與葉綠素合成扣光合作用相關(guān)的基因的表達均受到影響，表明YGL2在水稻葉綠素的合成和光合作用中具有重要的作用。YGL2的克隆為進一步闡明血紅素加氧酶在調(diào)節(jié)植物葉綠素合成和光合作用中的重要作用奠定了基礎(chǔ)。
　　第二部分:水稻籽粒堊白的產(chǎn)生嚴重影響稻米品質(zhì)，堊白是一個非常復(fù)雜的數(shù)量性狀，精細定位和克隆控制堊白的QTL不僅有助于闡

6、明水稻堊白形成的分子機制，同時還可以利用分子標(biāo)記輔助選擇的方法，提高育種效率。本研究中的C-51是一個以9311為輪回親本，PA64S為供體親本的染色體置換系材料，在不同環(huán)境下其堊白粒率均顯著高于背景親本9311，掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)C-51堊白部分淀粉顆粒呈圓形或橢圓形，排列疏松，大小不一，而9311透明部分淀粉顆粒呈現(xiàn)多角形多面體狀，棱角分明，淀粉粒相互嵌合緊密排列在一起，但是9311和C-51的灌漿速率和干物質(zhì)積累無顯著差異。本研究通

7、過對前人研究結(jié)果的驗證和進一步精細定位，最終將控制該堊白粒率的QTLqPGWC-7定位在第7染色體Indel18和Indel3兩標(biāo)記之間，區(qū)間大小約17.1kb。經(jīng)過預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，該區(qū)間包含3個ORFs，其中C-51中ORF1的表達量在整個灌漿過程中均高于9311，在開花后第18天表達量達到最大，并且C-51和9311在氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域存在一個氨基酸的改變，因此將該ORF1作為候選基因進行功能分析。體外酶活測定證明在高堊白粒率的C