水稻苗期白化致死基因OsPPR6的圖位克隆和功能分析.pdf

1、葉綠體是高等植物最關鍵的組成部分之一，因為它是唯一可以將太陽能吸收轉化為化學能供機體維持生命的細胞器。因此葉綠體的分化、發(fā)育和功能對于地球上的生命物質來說是至關重要的。
　　超過95％的葉綠體蛋白都是由核基因組編碼，然后被轉運進葉綠體內(nèi)的。在葉綠體中他們與質體編碼的蛋白一起組裝形成有功能的光合代謝復合物，因此前質體到葉綠體的分化是一個需要核-質基因協(xié)作的精細調(diào)控過程。在整個質體發(fā)育的復雜網(wǎng)絡中，任何一個相關基因的改變都有可能導致葉

2、綠體發(fā)育的異常，從而產(chǎn)生不同類型的葉色突變體。
　　在本研究中，我們鑒定并克隆了一個新的水稻PPR蛋白OsPPR6，該蛋白對于水稻葉片早期的葉綠體發(fā)育至關重要的作用。OsPPR6基因單堿基替換導致了苗期白化的葉片，同時伴隨著葉綠體發(fā)育的異常，葉綠素含量幾乎為零，水稻供能不足，導致死亡。OsPPR6是一個位于葉綠體內(nèi)的PPR蛋白，參與葉綠體基因ndhB的編輯和ycf3的剪接。本研究提出了OsPPR6在水稻葉綠體發(fā)育中重要的的功能，為

3、葉綠體的發(fā)育機制和PPR家族功能的多樣性提供了依據(jù)。主要研究結果如下:
　　1) osppr6突變體與野生型相比主要表型上的差異:突變體出苗就白化，待自身能量消耗完，兩葉一心期（15天）就枯萎而死。3％蔗糖處理發(fā)現(xiàn)，葉尖轉黃，逐漸變綠，說明突變體是因為能量供應不足而導致死亡的。葉綠素含量與葉片表型相對應;葉綠體觀察發(fā)現(xiàn):葉綠體中沒有典型的類囊體片層結構，而是產(chǎn)生空泡和嗜鋨顆粒，葉綠體形態(tài)和結構不正常，說明葉綠體發(fā)育不正常，無法形成

4、光合作用場所;編碼葉綠素合成相關基因都顯著下降，而與質體發(fā)育相關的基因表達異常，依賴PEP編碼的與光合結構有關的基因下調(diào)，依賴NEP編碼的與RNA聚合酶相關基因急劇上升，Western blot分析進一步證明了這一結果。這說明葉綠體發(fā)育停滯在第二時期。DAB和NBT染色發(fā)現(xiàn)突變體中ROS過量積累。
　　2)遺傳分析表明，osppr6屬于單基因隱性突變。通過圖位克隆鑒定到目的基因OsPPR6由于單堿基的替換產(chǎn)生了保守氨基酸變異;目標

5、基因是一個PPR蛋白家族成員，在大部分高等植物都有具有且同源基因之間氨基酸序列相對保守，且與擬南芥中AtECB2同源，屬于PLS亞家族，含有14個PPR基序的DYW亞群蛋白;通過互補和RNAi干擾轉基因驗證確實是OsPPR6突變導致白化致死的表型。
　　3) OsPPR6功能分析:借鑒前人的研究基礎，通過直接測序和RT-PCR發(fā)現(xiàn)，突變體葉綠體基因ndhB的737位堿基處沒有被編輯，從而導致氨基酸改變;同時也發(fā)現(xiàn)突變體中，ycf3