生物有機(jī)肥防控黃瓜土傳立枯病效果及防控機(jī)理.pdf

1、黃瓜（Cucumis sativus Linn）廣泛分布于世界各地，并且為主要的溫室產(chǎn)品之一。黃瓜土傳立枯病是一種土傳病害，主要由立枯絲核菌（Rhizoctonia solani Kühn）引起，在世界各地均有不同程度的發(fā)生，每年造成了大量的經(jīng)濟(jì)損失。土傳立枯病的防控是一個(gè)世界性的難題，傳統(tǒng)的化學(xué)和農(nóng)業(yè)防控措施通常會(huì)帶來(lái)環(huán)境問(wèn)題、食品安全問(wèn)題、成本高和勞動(dòng)強(qiáng)度大等問(wèn)題，因此不能成功的應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。而利用生物防控土傳病害由于具有高效、環(huán)

2、保等優(yōu)點(diǎn)日益受到人們重視。
　　 本文篩選出了對(duì)土傳立枯病病原菌立枯絲核菌具有高效拮抗作用的拮抗菌哈茨木霉SQR-T37(T37)和短小芽孢桿菌SQR-N43(N43)。利用這兩株高效拮抗菌及其生物有機(jī)肥進(jìn)行黃瓜土傳立枯病盆栽防控試驗(yàn)，并檢測(cè)了施用拮抗菌后根際土壤中病原菌和拮抗菌的數(shù)量，以及根際土壤中微生物區(qū)系的變化。研究了兩株高效拮抗菌在黃瓜根系的定殖作用，以及對(duì)病原菌拮抗的作用機(jī)理。繼而研究了植物根系分泌物對(duì)兩株高效拮抗菌的

3、影響。
　　 主要結(jié)果如下:
　　 1.利用科赫法則驗(yàn)證立枯絲核菌Q1是黃瓜土傳立枯病的致病菌株。采用平板對(duì)峙法從黃瓜根際土壤中分離出的400余株細(xì)菌菌株中篩選出16株對(duì)立枯絲核菌具有拮抗效果的菌株，抑菌帶直徑在0.8～1.9cm之間;并從中選出3株抑菌帶直徑在1.6cm以上的菌株N33、N35和N43，三株拮抗菌均能產(chǎn)生可溶性和揮發(fā)性的拮抗物質(zhì)，結(jié)合形態(tài)、生理生化特性及16S rDNA序列比對(duì)分析，鑒定N33菌株(登錄

4、號(hào)HM439651)為熒光假單胞菌Pseudomonas fluorescens，N35和N43菌株（登錄號(hào)GQ465936和GQ465935）為短小芽孢桿菌Bacillus pumilus。復(fù)篩確定短小芽孢桿菌SQR-N43和哈茨木霉Trichoderma harzianum SQR-T37菌株用于后續(xù)試驗(yàn)。
　　 2.通過(guò)盆栽試驗(yàn)研究了拮抗菌及其生物有機(jī)肥對(duì)黃瓜的促生效果和土傳立枯病的生物防控效果。結(jié)果表明短小芽孢桿菌SQR

5、-N43和哈茨木霉SQR-T37能顯著增加黃瓜地上部鮮重，與對(duì)照相比分別增加了38.6％和55.9％。拮抗菌N43和T37可以防控黃瓜土傳立枯病，而且T37第二季的防效是第一季防效的1.25倍;此外，生物有機(jī)肥的防效（68.2％和81.8％）顯著高于單獨(dú)施用拮抗菌N43和T37的防效(22.7％和27.3％)。施用拮抗菌后，植物根際病原菌的數(shù)量由每克土106 ITS拷貝數(shù)降低到每克土104 ITS拷貝數(shù)。單獨(dú)施用拮抗菌T37，接種后第0

6、天到第20天哈茨木霉的數(shù)量從的每克土107 ITS拷貝數(shù)降低到每克土105 ITS拷貝數(shù);生物有機(jī)肥的使用維持了拮抗菌T37的數(shù)量在每克土107 ITS拷貝數(shù);生物有機(jī)肥處理N43總數(shù)和N43芽孢數(shù)量所占百分比分別為1.67×108 CFU g-1土和51.9％，與單獨(dú)施用拮抗菌N43的處理（2.20×107 CFU g-1土和78.6％）相比有顯著差異。拮抗菌N43和T37及其生物有機(jī)肥降低了土壤中有害真菌的種類(lèi)，如立枯絲核菌Rhiz

7、octonia solani、玉米大斑病菌Setosphaeria sp.和油瓶霉Lecythophora;增加了土壤細(xì)菌的種類(lèi)和數(shù)量。綜上所述，拮抗菌和生物有機(jī)肥可以促進(jìn)黃瓜生長(zhǎng)、防控黃瓜土傳立枯病、降低根際土壤病原菌數(shù)量和改善根際土壤微生物區(qū)系，其中生物有機(jī)肥的處理效果最好。
　　 3.為了闡述哈茨木霉SQR-T37和短小芽孢桿菌SQR-N43對(duì)立枯絲核菌的拮抗機(jī)理，顯微觀察了兩株拮抗菌對(duì)病原菌菌絲的作用，并檢測(cè)了T37菌株

8、產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶活性，以及N43菌株分泌的拮抗物質(zhì)。結(jié)果表明:T37菌絲纏繞并穿透病原菌菌絲，造成病原菌菌絲細(xì)胞質(zhì)滲漏和細(xì)胞皺縮。新鮮的和烘干的病原菌細(xì)胞壁都可以誘導(dǎo)T37菌株幾丁質(zhì)酶（9.49和10.80 nkat ml-1粗酶液）和β-1，3-葡聚糖酶的產(chǎn)生（37.57和43.18 nkat ml-1粗酶液）。N43菌株在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期產(chǎn)生對(duì)立枯絲核菌Q1具有抑制作用的拮抗物質(zhì)，這種物質(zhì)造成了病原菌菌絲的頂端膨大和細(xì)

9、胞質(zhì)的滲漏。當(dāng)培養(yǎng)基中NaCl濃度為1％(w/v)時(shí)，拮抗物質(zhì)的活性達(dá)到最大值。70％飽和度的硫酸銨可以完全沉淀發(fā)酵液中的拮抗物質(zhì)。拮抗物質(zhì)經(jīng)蛋白酶K和胰蛋白酶處理后活性顯著下降，與對(duì)照相比分別降低了79％和53％。這種物質(zhì)分子量在500-1000Da之間，對(duì)高溫敏感，對(duì)堿性條件具有耐受性。拮抗物質(zhì)與N43細(xì)胞懸液對(duì)土傳立枯病的防控效果無(wú)顯著差異。綜上所述，T37菌株對(duì)立枯絲核菌Q1的拮抗機(jī)理為重寄生作用;N43菌株產(chǎn)生對(duì)立枯絲核菌Q1

10、具有拮抗作用的短肽類(lèi)活性物質(zhì)。
　　 4.本章構(gòu)建了綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)標(biāo)記的短小芽孢桿菌SQR-N43菌株(GFP-N43)，并研究了GFP-N43菌株和哈茨木霉SQR-T37在黃瓜根系的定殖能力。結(jié)果表明:構(gòu)建的GFP-N43菌株能發(fā)出綠色熒光;生長(zhǎng)到89代時(shí)，還有43.33％的菌株含有pHAPⅡ質(zhì)粒;GFP-N43菌株對(duì)立枯絲核菌Q1的抑制效果較N43菌株相比無(wú)顯著差異

11、;在每克土107和108 GFP-N43 CFU處理中，GFP-N43在植物根尖和伸長(zhǎng)區(qū)定殖并形成了穩(wěn)健的生物膜，保護(hù)植物根系不受病原菌侵害;定量結(jié)果表明在每克土107和108 GFP-N43 CFU處理中，GFP-N43菌體濃度有所下降，接種后14天的菌體濃度分別是每克土4.6×106 CFU和1.1×107 CFU;0到14天，105和106濃度的處理中GFP-N43的數(shù)量呈上升趨勢(shì)，第14天菌體濃度分別是第0天的3.55和2.09

12、倍;T37菌絲可以纏繞黃瓜根系，在黃瓜根表形成保護(hù)層。
　　 5.利用高效液相色譜鑒定了黃瓜根系分泌的有機(jī)酸，并檢測(cè)了拮抗菌短小芽孢桿菌SQR-N43對(duì)有機(jī)酸的趨化作用、哈茨木霉SQR-T37對(duì)有機(jī)酸的利用和有機(jī)酸對(duì)T37孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明:黃瓜根系分泌物中有機(jī)酸主要有草酸、蘋(píng)果酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸和延胡索酸。N43菌株對(duì)蘋(píng)果酸和檸檬酸具有濃度依賴(lài)性的正向趨化作用，趨化系數(shù)分別為3.1和2.3。除琥珀酸外，另