生物有機肥防控黃瓜土傳立枯病效果及防控機理.pdf

1、黃瓜（Cucumis sativus Linn）廣泛分布于世界各地，并且為主要的溫室產(chǎn)品之一。黃瓜土傳立枯病是一種土傳病害，主要由立枯絲核菌（Rhizoctonia solani Kühn）引起，在世界各地均有不同程度的發(fā)生，每年造成了大量的經(jīng)濟損失。土傳立枯病的防控是一個世界性的難題，傳統(tǒng)的化學(xué)和農(nóng)業(yè)防控措施通常會帶來環(huán)境問題、食品安全問題、成本高和勞動強度大等問題，因此不能成功的應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。而利用生物防控土傳病害由于具有高效、環(huán)

2、保等優(yōu)點日益受到人們重視。
　　 本文篩選出了對土傳立枯病病原菌立枯絲核菌具有高效拮抗作用的拮抗菌哈茨木霉SQR-T37(T37)和短小芽孢桿菌SQR-N43(N43)。利用這兩株高效拮抗菌及其生物有機肥進行黃瓜土傳立枯病盆栽防控試驗，并檢測了施用拮抗菌后根際土壤中病原菌和拮抗菌的數(shù)量，以及根際土壤中微生物區(qū)系的變化。研究了兩株高效拮抗菌在黃瓜根系的定殖作用，以及對病原菌拮抗的作用機理。繼而研究了植物根系分泌物對兩株高效拮抗菌的

3、影響。
　　 主要結(jié)果如下:
　　 1.利用科赫法則驗證立枯絲核菌Q1是黃瓜土傳立枯病的致病菌株。采用平板對峙法從黃瓜根際土壤中分離出的400余株細菌菌株中篩選出16株對立枯絲核菌具有拮抗效果的菌株，抑菌帶直徑在0.8～1.9cm之間;并從中選出3株抑菌帶直徑在1.6cm以上的菌株N33、N35和N43，三株拮抗菌均能產(chǎn)生可溶性和揮發(fā)性的拮抗物質(zhì)，結(jié)合形態(tài)、生理生化特性及16S rDNA序列比對分析，鑒定N33菌株(登錄

4、號HM439651)為熒光假單胞菌Pseudomonas fluorescens，N35和N43菌株（登錄號GQ465936和GQ465935）為短小芽孢桿菌Bacillus pumilus。復(fù)篩確定短小芽孢桿菌SQR-N43和哈茨木霉Trichoderma harzianum SQR-T37菌株用于后續(xù)試驗。
　　 2.通過盆栽試驗研究了拮抗菌及其生物有機肥對黃瓜的促生效果和土傳立枯病的生物防控效果。結(jié)果表明短小芽孢桿菌SQR

5、-N43和哈茨木霉SQR-T37能顯著增加黃瓜地上部鮮重，與對照相比分別增加了38.6％和55.9％。拮抗菌N43和T37可以防控黃瓜土傳立枯病，而且T37第二季的防效是第一季防效的1.25倍;此外，生物有機肥的防效（68.2％和81.8％）顯著高于單獨施用拮抗菌N43和T37的防效(22.7％和27.3％)。施用拮抗菌后，植物根際病原菌的數(shù)量由每克土106 ITS拷貝數(shù)降低到每克土104 ITS拷貝數(shù)。單獨施用拮抗菌T37，接種后第0

6、天到第20天哈茨木霉的數(shù)量從的每克土107 ITS拷貝數(shù)降低到每克土105 ITS拷貝數(shù);生物有機肥的使用維持了拮抗菌T37的數(shù)量在每克土107 ITS拷貝數(shù);生物有機肥處理N43總數(shù)和N43芽孢數(shù)量所占百分比分別為1.67×108 CFU g-1土和51.9％，與單獨施用拮抗菌N43的處理（2.20×107 CFU g-1土和78.6％）相比有顯著差異。拮抗菌N43和T37及其生物有機肥降低了土壤中有害真菌的種類，如立枯絲核菌Rhiz

7、octonia solani、玉米大斑病菌Setosphaeria sp.和油瓶霉Lecythophora;增加了土壤細菌的種類和數(shù)量。綜上所述，拮抗菌和生物有機肥可以促進黃瓜生長、防控黃瓜土傳立枯病、降低根際土壤病原菌數(shù)量和改善根際土壤微生物區(qū)系，其中生物有機肥的處理效果最好。
　　 3.為了闡述哈茨木霉SQR-T37和短小芽孢桿菌SQR-N43對立枯絲核菌的拮抗機理，顯微觀察了兩株拮抗菌對病原菌菌絲的作用，并檢測了T37菌株

8、產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶活性，以及N43菌株分泌的拮抗物質(zhì)。結(jié)果表明:T37菌絲纏繞并穿透病原菌菌絲，造成病原菌菌絲細胞質(zhì)滲漏和細胞皺縮。新鮮的和烘干的病原菌細胞壁都可以誘導(dǎo)T37菌株幾丁質(zhì)酶（9.49和10.80 nkat ml-1粗酶液）和β-1，3-葡聚糖酶的產(chǎn)生（37.57和43.18 nkat ml-1粗酶液）。N43菌株在對數(shù)生長期產(chǎn)生對立枯絲核菌Q1具有抑制作用的拮抗物質(zhì)，這種物質(zhì)造成了病原菌菌絲的頂端膨大和細

9、胞質(zhì)的滲漏。當(dāng)培養(yǎng)基中NaCl濃度為1％(w/v)時，拮抗物質(zhì)的活性達到最大值。70％飽和度的硫酸銨可以完全沉淀發(fā)酵液中的拮抗物質(zhì)。拮抗物質(zhì)經(jīng)蛋白酶K和胰蛋白酶處理后活性顯著下降，與對照相比分別降低了79％和53％。這種物質(zhì)分子量在500-1000Da之間，對高溫敏感，對堿性條件具有耐受性。拮抗物質(zhì)與N43細胞懸液對土傳立枯病的防控效果無顯著差異。綜上所述，T37菌株對立枯絲核菌Q1的拮抗機理為重寄生作用;N43菌株產(chǎn)生對立枯絲核菌Q1

10、具有拮抗作用的短肽類活性物質(zhì)。
　　 4.本章構(gòu)建了綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)標(biāo)記的短小芽孢桿菌SQR-N43菌株(GFP-N43)，并研究了GFP-N43菌株和哈茨木霉SQR-T37在黃瓜根系的定殖能力。結(jié)果表明:構(gòu)建的GFP-N43菌株能發(fā)出綠色熒光;生長到89代時，還有43.33％的菌株含有pHAPⅡ質(zhì)粒;GFP-N43菌株對立枯絲核菌Q1的抑制效果較N43菌株相比無顯著差異

11、;在每克土107和108 GFP-N43 CFU處理中，GFP-N43在植物根尖和伸長區(qū)定殖并形成了穩(wěn)健的生物膜，保護植物根系不受病原菌侵害;定量結(jié)果表明在每克土107和108 GFP-N43 CFU處理中，GFP-N43菌體濃度有所下降，接種后14天的菌體濃度分別是每克土4.6×106 CFU和1.1×107 CFU;0到14天，105和106濃度的處理中GFP-N43的數(shù)量呈上升趨勢，第14天菌體濃度分別是第0天的3.55和2.09

12、倍;T37菌絲可以纏繞黃瓜根系，在黃瓜根表形成保護層。
　　 5.利用高效液相色譜鑒定了黃瓜根系分泌的有機酸，并檢測了拮抗菌短小芽孢桿菌SQR-N43對有機酸的趨化作用、哈茨木霉SQR-T37對有機酸的利用和有機酸對T37孢子萌發(fā)和菌絲生長的影響。結(jié)果表明:黃瓜根系分泌物中有機酸主要有草酸、蘋果酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸和延胡索酸。N43菌株對蘋果酸和檸檬酸具有濃度依賴性的正向趨化作用，趨化系數(shù)分別為3.1和2.3。除琥珀酸外，另