抗甜瓜枯病生防菌及其生物有機(jī)肥的生防機(jī)理研究.pdf

1、甜瓜是世界十大水果之一，廣泛種植于溫帶和熱帶地區(qū)，中國(guó)甜瓜種植面積和產(chǎn)量分別占世界的48.5％和56.3%。甜瓜枯萎病是一種維管束病害，由甜瓜專化型枯萎病菌尖孢鐮刀茵（Fusarium oxysporumf sp melonis）引起，在甜瓜全生育期均可發(fā)生。近20年來(lái)，隨著保護(hù)地栽培方式大范圍推廣，連作甜瓜枯萎病發(fā)生更趨嚴(yán)重，甜瓜枯萎病的防治是一種世界性的難題，傳統(tǒng)的化學(xué)及農(nóng)業(yè)防治措施通常會(huì)帶來(lái)環(huán)境問(wèn)題或成本高、勞動(dòng)強(qiáng)度大等不能成功的

2、應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)．目前，對(duì)于生物防治甜瓜枯萎病雖有報(bào)道，但僅局限于生防效果方面，對(duì)機(jī)理方面研究甚少，另外，可供商品化開(kāi)發(fā)應(yīng)用的生防產(chǎn)品并不多。
　　 本論文在分離獲得5株對(duì)甜瓜枯萎病原茵具有高效拮抗作用細(xì)菌的基礎(chǔ)上，研制出一種抗甜瓜枯萎病的專用生物有機(jī)肥，通過(guò)盆栽、大田及室內(nèi)試驗(yàn)研究了其生防效果與機(jī)理，采用綠色熒光蛋白標(biāo)記技術(shù)對(duì)生防菌株枯草芽孢桿菌Y-IVI進(jìn)行了標(biāo)記，并通過(guò)盆栽及室內(nèi)檢測(cè)試驗(yàn)研究了其對(duì)甜瓜生長(zhǎng)的促生作用及在根際土

3、壤及植株體內(nèi)的定殖情況。
　　 主要結(jié)果如下：
　　 1．甜瓜枯萎病致病菌的分離是生物防治此病害的前提工作．從安徽和縣采集甜瓜枯萎病發(fā)病植株，用尖孢鐮刀菌選擇性培養(yǎng)基分離獲得致病菌。通過(guò)菌落形態(tài)及大、小型分生孢子，厚垣孢子顯微觀察結(jié)果表明分離到的菌株為尖孢鐮刀菌。根據(jù)柯赫法則用孢子懸液接種甜瓜幼苗20d后，枯萎病發(fā)病率達(dá)到80%．因此，可以確定分離得到的尖孢鐮刀菌為甜瓜枯萎病致病菌．以其為靶標(biāo)菌株，利用平板對(duì)峙法從健康甜

4、瓜植株根際土壤中初篩獲得對(duì)枯萎病病原菌有顯著拮抗作用的5株細(xì)菌(Y-6，Y-8，Y-1O，Y-12，Y-IVI)及2株真菌(A1，PI)。5株拮抗細(xì)菌發(fā)酵液對(duì)甜瓜種子萌發(fā)均無(wú)抑制作用。與對(duì)照相比，經(jīng)菌株Y-1O，Y-IVI處理的甜瓜種子發(fā)芽率分別提高了10%和5%，胚根長(zhǎng)度顯著高于其余3株拮抗細(xì)菌發(fā)酵液的處理。拮抗菌株發(fā)酵液對(duì)病原菌的生長(zhǎng)均有顯著的抑制作用，菌株Y-6、Y-8、Y-1O、Y-12和Y-IVI發(fā)酵液濃度為10%時(shí)對(duì)病原菌的

5、抑制率分別為54%、67%、75.3%、68%和72.4%，表明菌株Y-10，Y-IVI抑菌效果強(qiáng)于其它菌株。室內(nèi)檢測(cè)結(jié)果表明菌株Y-IVI可產(chǎn)生鐵載體、吲哚乙酸和氨等促生類物質(zhì)。經(jīng)生理生化及16S rDNA分子鑒定，確定Y-1O，Y-IVI分別為多粘類芽孢桿菌（Genbank accession number GQ849013）和枯草芽孢桿菌(Genbank accession numberGQ475486)．
　　 2．通過(guò)

6、盆栽試驗(yàn)研究了堆肥和拮抗菌株Y-IVI、Y-10、A1和P1固體二次發(fā)酵生產(chǎn)的生物有機(jī)肥對(duì)甜瓜枯萎病的生防效果。結(jié)果表明：施用生物有機(jī)肥降低了枯萎病發(fā)病率并提高了植株生物量，營(yíng)養(yǎng)缽育苗和盆缽移栽時(shí)均施用生物有機(jī)肥的處理甜瓜枯萎病發(fā)病率為20%，而對(duì)照的發(fā)病率為80%；施用生物有機(jī)肥顯著降低了甜瓜植株莖和根系中病原菌的數(shù)量，營(yíng)養(yǎng)體育苗和盆缽移栽時(shí)均施用生物有機(jī)肥II的處理甜瓜植株莖和根系中病原茵的數(shù)量分別為2.27×103和6.67×10

7、3CFU g-1FW，而對(duì)照植株莖和根系病原菌數(shù)量分別為8.17×104和3.67×104 CFU g-1FW，病原菌分別降低了97%和82%；施用生物有機(jī)肥改變了土壤微生物區(qū)系，根際土壤中細(xì)菌、放線菌數(shù)量與對(duì)照相比顯著增加，而真菌和病原菌數(shù)量大大減少；營(yíng)養(yǎng)體育苗和盆缽移栽時(shí)均施用生物有機(jī)肥的甜瓜植株葉片中與抗病相關(guān)的酶活性低于對(duì)照?？傊?，營(yíng)養(yǎng)缽育苗和大田移栽時(shí)均施用生物有機(jī)肥可顯著降低甜瓜枯萎病發(fā)病率，提高產(chǎn)量并改善土壤微生物區(qū)系．之

8、后，用綠色熒光蛋白標(biāo)記Y-IVI(GY-IVI)研究了其對(duì)甜瓜生長(zhǎng)的促生作用及其在甜瓜植株體內(nèi)及根際土壤中定殖的情況，結(jié)果表明：種子和土壤均經(jīng)過(guò)標(biāo)記菌株GY-IVI處理(GY-IVIs+GY-IVIp)的甜瓜植株地上部、根系干重等顯著高于對(duì)照；接種30d后處理GY-WIs+GY-IVIp根際土壤中標(biāo)記菌株GY-IVI仍維持在108 CFUg-1DW，與接種時(shí)的濃度相比并無(wú)顯著性變化，而甜瓜植株莖及根系內(nèi)部標(biāo)記菌株GY-IVI的含量分別為

9、106和107 CFU g-1DW，在對(duì)照處理的根際及植株體內(nèi)均未檢測(cè)到標(biāo)記菌株，綜上所述，菌株GY-IVI能促進(jìn)甜瓜植株的生長(zhǎng)并能夠穩(wěn)定的定殖在根際土壤和植株內(nèi)部而對(duì)植物產(chǎn)生促生作用。
　　 3．室內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果表明：拮抗菌株B.subtilis Y-IVI發(fā)酵液稀釋10倍后對(duì)病原菌仍具有拮抗作用；發(fā)酵液中產(chǎn)生的抗真菌活性物質(zhì)耐酸，耐熱，在pH2處理24 h或80℃水浴2h后仍有拮抗作用，并且對(duì)胃蛋白酶和蛋白酶K穩(wěn)定。用HC1沉淀

10、法從發(fā)酵液中提取出脂肽類粗提物，此粗提物對(duì)多種病原真菌具有抑制作用。用高效液相色譜反復(fù)純化粗提物，最終收集到2個(gè)對(duì)病原真菌具有較強(qiáng)抑制作用的色譜峰。通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定其分子量分別為1028.7、1042.7、1056.7和1463、1477、1491Da，這兩組物質(zhì)分別屬于伊枯草菌素A和芬枯草菌素．菌株Y-IVI在Landy培養(yǎng)基中產(chǎn)伊枯草菌素最高濃度為89.75 mgL-1．
　　 4．通過(guò)盆栽試驗(yàn)研究了菌株Y-IVI制成的生

11、物有機(jī)肥(BIO)對(duì)甜瓜枯萎病的防效及其生防機(jī)理。結(jié)果表明，營(yíng)養(yǎng)缽育苗和盆缽移栽時(shí)均施用BIO的處理與對(duì)照相比，甜瓜枯萎病發(fā)病率降低了9l‰干重增加了3倍。施用BIO能顯著降低病原菌在植株莖、根際土及非根際土中的數(shù)量，而且拮抗菌株Y-IVI能成功定殖在甜瓜植株莖及根際土壤中，移栽10-60 d內(nèi)拮抗菌株Y-WI在根際土壤中的數(shù)量維持在107 CFU－1土。營(yíng)養(yǎng)缽育苗施用BIO的甜瓜根際土壤中抗菌脂肽類物質(zhì)iturinA的含量為78ug.

12、g'1FW。移栽10d時(shí)施用BIO的甜瓜植株葉片中水楊酸含量為17.5ug'g-1FW，顯著高于對(duì)照。綜上所述，施用BIO能有效地防治甜瓜枯萎病，其主要機(jī)制是拮抗菌株Y-IVI能成功的定殖在甜瓜植株體內(nèi)及根際土壤中，防止病原菌的入侵，且能在甜瓜植株根際產(chǎn)生抗病原真菌的活性物質(zhì)iturin A以抑制病原菌生長(zhǎng)繁殖。此外，Y-IVI能誘導(dǎo)甜瓜產(chǎn)生系統(tǒng)抗性。我們首次從植物－土壤一生防菌－病原菌相互作用的根際土壤中成功檢測(cè)并定量了抗菌脂肽類物質(zhì)