二化螟trypsin、cathepsin和serpin基因的分子克隆及功能分析.pdf

1、二化螟Chilosuppressalis屬鱗翅目（Lepidoptera），草螟亞科（Crambidae），在中國的分布廣泛（北達黑龍江克山縣，南至海南島）。幼蟲蛀食水稻莖稈，造成枯心，且具有越冬場所多（寄主有水稻、玉米、甘蔗、粟、蠶豆、茭白、高粱、油菜、小麥、紫云英等）、轉(zhuǎn)株鉆蛀為害等特點。上世紀(jì)90年代以來，水稻二化螟對水稻的為害一直較重。長期的化學(xué)防治使二化螟抗藥性不斷增強，不少常規(guī)防治藥劑相繼被淘汰。由于化學(xué)防治的局限性，生產(chǎn)上

2、迫切需要開發(fā)新的手段用于害蟲防治。中腸是昆蟲與植物互作的主要場所，其消化酶是新農(nóng)藥開發(fā)和培育轉(zhuǎn)基因抗性水稻品種的潛在靶標(biāo)。胰蛋白酶（trypsin）、組織蛋白酶（cathepsin）及絲氨酸蛋白酶抑制劑（serpin）是與中腸消化有關(guān)的主要酶類。盡管這些蛋白酶及抑制劑一直是國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點，二化螟的蛋白酶及抑制劑基因家族的研究尚未引起足夠重視。另外，隨著基因組測序、轉(zhuǎn)錄組測序和蛋白組測序等組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，相關(guān)研究手段已廣泛用于基因的

3、高通量鑒定。本研究作為973預(yù)研項目的一部分，將水稻螟蟲作為主要的研究對象，系統(tǒng)分析了二化螟的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對其消化相關(guān)的蛋白酶及其抑制劑基因進行了克隆、功能分析和啟動子調(diào)控機制的研究，主要結(jié)果如下:
　　1.二化螟轉(zhuǎn)錄組分析及候選序列的驗證
　　用二化螟各齡期試蟲混合樣品提取的總RNA構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組文庫，運用二代測序技術(shù)(Illumina)獲得25，783，374條二化螟短讀序列(shortreads)（由華大完成）。通過生物信

4、息軟件進行序列組裝和聚類后得到116，262條unigenes，同源搜索NCBInr數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)其中27，181條序列與已報道基因同源。對這27181條序列進行nr、GO、COG和KEGG注釋后，初步揭示了這些基因的功能、所屬的24個COG分類和參與KEGG的過程?；谏镄畔⒆⑨尯褪謩幼⑨專炞C了其中72條胰蛋白酶、11條組織蛋白酶和12條絲氨酸蛋白酶抑制劑的基因序列。
　　2.胰蛋白酶、組織蛋白酶及絲氨酸蛋白酶抑制劑基因的全長克

5、隆
　　利用RACE技術(shù)對上述基因進行全長序列克隆后，得到28條（10條全長序列、18條為5'或3'端截短）胰蛋白酶cDNA序列、8條（5條全長序列、3條為5'或3'端截短）組織蛋白酶cDNA序列和11條（10條全長，1條為5'端截短）絲氨酸蛋白酶抑制劑cDNA序列。它們推導(dǎo)的氨基酸序列與鱗翅目對應(yīng)基因的氨基酸序列具有較高相似性。序列結(jié)構(gòu)和特征位點分析表明:克隆的胰蛋白酶全長cDNA序列中CT004、CT005、CT007、CT0

6、08、CT009和CT010編碼胰蛋白酶基因，CT001、CT002、CT011和CT012編碼胰凝乳蛋白酶基因，CT006編碼絲氨酸蛋白酶同系物?？寺〉慕M織蛋白酶全長cDNA序列中CCL1～CCL5編碼組織蛋白酶L型，CCO1和CCO2編碼O型，CCB1編碼B型，CCF1編碼F型。絲氨酸蛋白酶抑制劑cDNA序列中CS001、CS003、CS005、CS007和CS010編碼胰蛋白酶抑制劑基因，CS002、CS006、CS008和CS0

7、13編碼胰凝乳蛋白酶抑制劑基因，CS011編碼未知抑制特性的抑制劑基因，CS004和CS012編碼混合型蛋白酶抑制劑，CS004可能同時抑制胰蛋白酶和彈性蛋白酶，CS0012可能同時抑制胰凝乳蛋白酶和凝血酶。
　　3.三類基因的組織表達及功能分析
　　組織表達分析結(jié)果表明:絕大部分trypsin基因都在二化螟中腸高表達，且同時分布于二化螟絕大部分的組織中;絕大部分serpin基因都在中腸中表達，均勻分布于二化螟大部分組織;大

8、部分cathepsin基因集中分布于血淋巴，其次是中腸，其他組織也有分布。沒有發(fā)現(xiàn)組織特異性trypsin、cathepsin或者serpin基因。
　　寄主轉(zhuǎn)換實驗結(jié)果表明:1）取食小麥后，胰蛋白酶基因CT002、CT007、CT008、CT010和CT012，組織蛋白酶基因CCL4和絲氨酸蛋白酶抑制劑基因CS007和CS008在幼蟲體內(nèi)表達量顯著上調(diào)，其中CT008、CT010和CS007極顯著上調(diào);CS001和CCL3顯著下

9、調(diào)。2）取食茭白后，胰蛋白酶基因CT002、CT005、CT007和CT008，組織蛋白酶基因CCO1和CCL4和絲氨酸蛋白酶抑制劑基因CS002和CS007在幼蟲體內(nèi)表達量顯著上調(diào)，其中CT007、CT008、CT005、CCL4、CS002和CS007極顯著上調(diào);CT012、CS001和CCL3的表達量顯著下調(diào)，其中CT012極顯著下調(diào)。3）CT002、CT007、CT008、CS007和CCL4的表達量在幼蟲取食茭白和小麥后均顯著

10、上調(diào)，CS001和CCL3的表達量在幼蟲取食茭白和小麥后均顯著下調(diào)。
　　饑餓實驗表明:1）二化螟幼蟲饑餓24h后，胰蛋白酶基因CT002、CT005、CT006、CT007、CT008、CT009和CT0011，組織蛋白酶基因CCL1、CCL4和CCB1和絲氨酸蛋白酶抑制劑基因CS001、CS002、CS007、CS008和CS013的表達量顯著下調(diào)，其中CT002、CCL4、CCB1、CS007和CS013極顯著下調(diào);胰蛋白酶

11、基因CT004和組織蛋白酶基因CCO1和CCL5顯著上調(diào)。2）饑餓48h后，胰蛋白酶基因CT001、CT002、CT005、CT006、CT007、CT008、CT009、CT011和CT0012的表達量顯著下調(diào)，其中CT006、CT007、CT008、CT011和CT0012極顯著下調(diào)。3）然而，與饑餓48h的幼蟲的表達量相比，饑餓24h再取食24h后的幼蟲的胰蛋白酶基因CT001、CT002、CT005、CT006、CT007、CT

12、008、CT009、CT011、CT0012，組織蛋白酶基因CCB1、CCL1和絲氨酸蛋白酶抑制劑基因S001、CS002、CS006、CS007的表達量顯著上調(diào)，其中CT012和CS006的表達量極顯著上調(diào);組織蛋白酶基因CCO1和CCO2，以及絲氨酸蛋白酶抑制劑基因CS010、CS004和CS005的表達量顯著下調(diào)，其中CS010、CS004和CS005極顯著下調(diào)。表明大部分二化螟胰蛋白酶、組織蛋白酶和絲氨酸蛋白酶抑制劑參與了食物消

13、化過程。
　　干擾實驗中，注射不同dsRNA（dsCCL2、dsCC01和dsCCB1）72h后，與陰性對照注射dseGFP實驗組相比，CCL2、CC01和CCB1基因的mRNA水平在12h后顯著下降，24h降至最低（分別下調(diào)了83.3％，67.9％和81.9％）后開始回升。同時，幼蟲存活率在12h顯著下降，直至60h達到最低（分別下降了58.9％、63.3％和60％）。敲低CCL2、CC01和CCB1基因的表達量后，二化螟幼蟲的

14、死亡率明顯增高，表明dsCCL2、dsCC01和dsCCB1具有殺蟲活性。
　　4.CT008基因啟動子區(qū)活性分析及幾個基因原核表達載體的構(gòu)建
　　本文克隆了CT008基因5'非翻譯區(qū)(unstranslatedregion，UTR)的調(diào)控區(qū)序列(7，676bp)，其中包括長度為1，822bp的鄰近啟動子調(diào)控序列。通過生物信息軟件，在鄰近啟動子序列中發(fā)現(xiàn)了36類共142個可能的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控位點。構(gòu)建了6個以二化螟CT008基

15、因5'端側(cè)翼啟動子區(qū)缺失片段為啟動子的表達報告基因螢火蟲熒光素酶（Lue）的重組質(zhì)粒，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞后檢測Lue活性。研究結(jié)果表明CT008基因5'非翻譯區(qū)-482～-197bp處含抑制啟動子活性的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，-739～-482bp處含增強啟動子活性的位點，-1137～-920bp區(qū)域存在下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。此外，本文成功構(gòu)建了6個消化相關(guān)基因(pET30a-CS007、pET30a-CS003、pET30a-CT0

16、08、pET30a-CT004、pET30a-CT005、pET30a-CCO2)的原核表達載體，且通過實驗證實都能在IPTG的誘導(dǎo)下表達。
　　本論文結(jié)合二化螟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和分子克隆，成功克隆了與二化螟消化和免疫相關(guān)的基因序列，分析其蛋白結(jié)構(gòu)及催化特征位點并對其表達譜進行了比較。在此基礎(chǔ)上，通過寄主轉(zhuǎn)換、饑餓再取食和RNAi分析了這些酶的潛在功能。此外還克隆了蛋白酶基因CT008的5'側(cè)翼區(qū)啟動子序列，分析了其序列結(jié)構(gòu)和調(diào)控功能。