柞蠶類serpin-1基因的鑒定與功能分析.pdf

1、柞蠶(Antheraea pernyi)最早在中國山東地區(qū)發(fā)現(xiàn)并開始養(yǎng)殖馴化，是我國重要的一類野生絹絲昆蟲。絲氨酸蛋白酶抑制劑(serpin)在昆蟲的先天免疫中通過與絲氨酸蛋白酶相互制約達到一定的動態(tài)平衡，從而調(diào)節(jié)生物體內(nèi)很多的生命活動，在昆蟲的先天免疫中發(fā)揮重要的作用。本文主要研究serpin-like基因的表達模式和在柞蠶先天免疫中的功能，研究結果如下:
　　本研究利用PCR技術成功克隆并獲得一個讀碼框為837bp的serpi

2、n-1like基因，其含有一個保守的serpin結構域，進化樹分析顯示其與印度柞蠶親緣關系最近，同源性高達為82.1％。
　　通過構建原核表達載體pET-28a-Ap-serpin-like，并經(jīng)不同濃度IPTG誘導成功獲得了重組pET-28a-Ap-serpin-1like蛋白。大量誘導后使用蛋白純化柱對重組蛋白進行純化，得到濃度和純度都非常高的pET-28a-Ap-serpin-1like蛋白，蛋白濃度約為0.5mg/ml。以

3、獲得的重組蛋白為抗原免疫新西蘭大白兔，通過實驗室常規(guī)取血方法取血得到Ap-serpin-1like抗體并檢測效價約為1∶128000。
　　利用PCR技術和Western Blot實驗操作方法檢測serpin-llike基因在柞蠶五齡三天幼蟲的血淋巴、表皮、絲腺、脂肪體、中腸和馬氏管中的表達情況，結果表明Ap-serpin-like在柞蠶中屬于組成性表達，在脂肪體中表達最高，在血淋巴中表達量最低。
　　同時利用實時定量PCR

4、技術檢測柞蠶不同發(fā)育階段serpin-1like基因的表達情況，發(fā)現(xiàn)serpin-1like在蛹期表達量最高，在四齡時候表達量低，其他幾個齡期表達差異不顯著。
　　隨后研究了在四種病原微生物刺激下柞蠶五齡三天幼蟲免疫功能所受到的影響。利用實時定量PCR技術分別檢測脂肪體、血淋巴和中腸中Ap-serpin-like基因在病原微生物刺激后的轉錄表達水平。實驗結果表明在三種組織中都能明顯上調(diào)或下調(diào)Ap-serpin-like的表達。

5、r>　　實驗發(fā)現(xiàn):在脂肪體中，Ap-serpin-1like除了注射B.bassiana在24-48h下調(diào)之外，其他三種菌的各個時間段均表達量上調(diào)，但各時間段上調(diào)程度有所不同。在血淋巴中，注射B.bassiana和M.luteus，Ap-serpin-1like mRNA表達量在24h達到最高，而注射E.coli在第一個檢測時間點1.5h的時候表達量高于其他的檢測時間點。柞蠶的中腸中，表達情況是有所不同的:注射B.bassiana對柞蠶

6、刺激后，Ap-serpin-1like mRNA在48h表達明顯高于其他的時間段。注射NPV后Ap-serpin-like在24h表達水平達到最高。M.luteus誘導后，Ap-serpin-like的轉錄水平在1.5h表達量最高。而注射E.coli對Ap-serpin-1like mRNA表達影響較小。
　　綜上所述，Ap-serpin-1like在柞蠶的先天性免疫應答中可能有重要的作用和功能，本研究可以為進一步從分子水平上解釋