2009年--醫(yī)學(xué)外文翻譯--腫瘤和內(nèi)皮細(xì)胞之間腫瘤逃逸與notch3-dll4交聯(lián)相關(guān)（譯文）

1、<p><b>　　中文4700字</b></p><p>　　出處：Indraccolo S, Minuzzo S, Masiero M, et al. Cross-talk between Tumor and Endothelial Cells Involving the Notch3-Dll4 Interaction Marks Escape from Tumor Dorma

2、ncy[J]. Cancer Research, 2009, 69(4):1314-23.</p><p>　　腫瘤和內(nèi)皮細(xì)胞之間腫瘤逃逸與Notch3-Dll4交聯(lián)相關(guān)</p><p><b>　　摘要：</b></p><p>　　dll4在生理血管形成和腫瘤血管形成中都有作用，它調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的notch活性。dll4在腫瘤細(xì)胞中作用于no

3、tch信號通路的效應(yīng)表達(dá)依然存在，然而，這沒有被廣泛認(rèn)識。這里，我們報道了人T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病或結(jié)直腸癌細(xì)胞從休眠中逃逸與腫瘤微環(huán)境中的dll4表達(dá)和腫瘤細(xì)胞中增加的notch3信號通路相關(guān)。</p><p><b>　　介紹</b></p><p>　　許多研究解釋了dll4-notch通路在血管形成的作用和減弱的dll4-notch活性導(dǎo)致潛在血管缺陷的機(jī)制

4、。然而，在腫瘤血管中也發(fā)現(xiàn)dll4，一些學(xué)者最近報道了干擾dll4/notch交聯(lián)可能影響腫瘤血管形成和生長。這些研究主要集中在了內(nèi)皮細(xì)胞特異性dll4/notch通路，而dll4在腫瘤細(xì)胞notch通路中的可能作用還沒建立起來。我們將腫瘤休眠的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ絹硌芯窟@個問題。因?yàn)門-ALL細(xì)胞表達(dá)notch受體和notch在T-ALL脫調(diào)節(jié)的病理狀態(tài)，我們建成了一個T-ALL的細(xì)胞休眠子。事實(shí)上，激活的notch1突變已發(fā)現(xiàn)在人T-ALL中大

5、于50%，并且notch3蛋白的過表達(dá)也在所有的T-ALL的病例中報導(dǎo)，除去notch3位點(diǎn)的嚴(yán)重異常情況。這些細(xì)胞中激活的notch的致瘤能力也在鼠骨髓前體細(xì)胞的白血病的發(fā)生過程中，這些細(xì)胞由notch1胞內(nèi)域轉(zhuǎn)導(dǎo)或加強(qiáng)dll4或notch3信號通路表達(dá)之后形成。</p><p>　　我們通過腫瘤模型證實(shí)通過微環(huán)境相互作用可以調(diào)節(jié)notch3的活性，揭示了其在腫瘤血管形成中的新作用。</p>&l

6、t;p><b>　　材料和方法</b></p><p>　　細(xì)胞系和體外培養(yǎng)。人類t淋巴細(xì)胞細(xì)胞株MOLT-3和Jurkat從美國購買。TALL1細(xì)胞a Ferrando(哥倫比亞大學(xué)提供)。t所有的細(xì)胞系是生長在RPMI 1640補(bǔ)充10% FCS和1% L谷氨酰胺(生命技術(shù);完整的RPMI)。MOLT-3基本成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF細(xì)胞已經(jīng)得到人類的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)

7、轉(zhuǎn)移到親代的的MOLT-3 cDNA bFGF細(xì)胞,作為詳細(xì)的其他地方。GT是一個細(xì)胞系來源于成長MOLT-3腫瘤注射獲得父母MOLT-3細(xì)胞成肥胖癥患者糖尿病嚴(yán)重結(jié)合南卡羅來納州免疫缺陷(點(diǎn)頭/ SCID)小鼠存在外源性bFGF。MICOL-14細(xì)胞系的源自一個轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌,生長在完整的RPMI。MICOL14細(xì)胞不是在SCID小鼠腫瘤發(fā)生的點(diǎn)頭/下面描述的實(shí)驗(yàn)條件下,腫瘤發(fā)生的變異細(xì)胞,稱為MICOL-14tum MICOL-14

8、,獲得從腫瘤發(fā)生在點(diǎn)頭/ SCID小鼠身上注射后的父母MICOL-14南卡羅來納州細(xì)胞在基底膜基質(zhì)加上白介素8(100 ng / mL)。在小鼠皮膚微血管EC線SIEC獲得a博士維奇單獨(dú)訓(xùn)練(馬里奧·內(nèi)格研究所)。SIEC細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)補(bǔ)</p><p>　　致瘤性試驗(yàn)。SCID小鼠是購自Charles Rivers公司。關(guān)于動物和他們的護(hù)理程序符合機(jī)構(gòu)的指導(dǎo)方針,符合國家及國際法律和政策(歐共體理

9、事會指令86/609,OJ L 358年12月12日,1987年)。建立腫瘤,7周老來9周老雌小白鼠注射3.0×106細(xì)胞南卡羅來納州在300 -μl總?cè)莘e為兩背外側(cè)側(cè)面,腫瘤生長的兩翼相提并論。在實(shí)驗(yàn)中,旨在調(diào)查Dll4的表達(dá)和灌注動力學(xué)的血管,MOLT-3-bFGF細(xì)胞注射結(jié)合人工基底膜(bd)。測試的療效Dll4封鎖,anti-Dll4麥布YM152F最初是與腫瘤細(xì)胞和隨后皮下注射給每3d(10μg/g)。在一組實(shí)驗(yàn)中,

10、小鼠注射南卡羅來納州兩側(cè)與0.5×106 MICOL-14或MICOL-14tum細(xì)胞。結(jié)果腫瘤檢查每周2次,以卡尺;腫瘤體積與下面的公式計算:腫瘤體積(mm3)= L××0.5,其中L l2是最長的直徑,L是最短的直徑,0.5是一個常數(shù)來計算體積的一個橢球體。</p><p>　　光學(xué)成像的腫瘤。進(jìn)行在體成像,結(jié)合腫瘤細(xì)胞與lentiviral向量編碼基因EGFP的記者獲得一EGF

11、P +細(xì)胞群。EGFP +細(xì)胞被注入在麻醉小鼠南卡羅來納州。注射后立即和幾個時間點(diǎn)之后,獲得的圖像使用探索Optix系統(tǒng)(通用電氣醫(yī)療集團(tuán))在一個固定的積分時間(0.3秒)和掃描步驟(1.5毫米),激光功率值(μW)是適應(yīng)達(dá)到70%(光子/ s)的最大激光功率。分析圖像進(jìn)行探索Optix OptiView使用軟件(通用電氣醫(yī)療集團(tuán));一個是手動選擇感興趣區(qū)域的周圍的信號強(qiáng)度。熒光計算為總強(qiáng)度(歸一化計數(shù)(數(shù)控)×面積(平方毫米

12、)]。</p><p>　　免疫印跡分析。細(xì)胞于7.5%到10%聚丙烯酰胺凝膠中酶解;分離蛋白質(zhì)被孵育2 h在400毫安到硝酸纖維膜。Immunoprobing都使用一個兔多克隆抗體對人類Notch3(santa cruz),一只兔子單克隆抗體對人類Notch1(細(xì)胞信號技術(shù)),一個兔多克隆抗體對Dll4(自行),一個兔多克隆anti-β-actin或鼠標(biāo)多克隆anti-α-tubulin(購自sigma公司),

13、其次是雜交與1:5,000稀釋或antimouse antirabbit辣根過氧化物酶結(jié)合抗體(amersham淀粉微球)。抗原被確定使用SuperSignal發(fā)光可視化工具包(皮爾斯)。信號強(qiáng)度測量使用生物rad XRS化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)。下面的數(shù)字顯示的樂隊之間的比例的蛋白質(zhì)(Notch3或Dll4)和α-tubulin或β-actin樂隊規(guī)范化設(shè)置在1中獲取的值從一個選定的樣本。</p><p>　　評價Dl

14、l4表達(dá),形成血管,灌注標(biāo)記。對免疫熒光分析,5-μm-thick石蠟包埋或冷凍腫瘤部分被孵育要么鼠anti-CD31(bd)或兔anti-Dll4主要抗體,水洗,孵育山羊antirat Alexa螢石546,antirat Alexa螢石488,或antirabbit Alexa螢石488(表達(dá)載體)二次抗體。</p><p>　　測量灌注,老鼠注射右旋糖酐70 -牛血清白蛋白(表達(dá)載體;360μmol / L

15、,50μL /鼠標(biāo))5分鐘前犧牲。灌注血管被可視化在共焦顯微鏡(蔡司)。細(xì)胞核被沾到pro三碘化物(表達(dá)載體)。激光掃描共聚焦顯微鏡進(jìn)行了一個蔡司顯微鏡使用氬LSM 510(488 nm)和氦氖(543 - 633 nm)激光源。分析了不同的字段數(shù),每節(jié)之間3和7,根據(jù)腫瘤大小,至少四個部分每個時間點(diǎn)進(jìn)行了分析。在放大的圖片收集200×400×或。微脈管密度(偏移速度測定)是通過篩選CD31-stained量化的部分

16、地區(qū)的最高多血管;10代表字段在放大400×對于每個腫瘤被數(shù)。</p><p>　　實(shí)時半定量PCR。總RNA是孤立使用RNeasy迷你包(試劑盒)根據(jù)制造商的說明?；パa(bǔ)脫氧核糖核酸的合成從0.5到1μg總RNA的使用上標(biāo)二世第一鏈系統(tǒng)存在逆向(表達(dá)載體)。定量PCR(定量酵素聚合反應(yīng)技術(shù))分析,SYBR綠色染料(表達(dá)載體)和基因序列檢測系統(tǒng)音箱5700(PE生物系統(tǒng)公司)被使用。相對量化是通過使用ΔΔ

17、Ct方法,對β2-microglobulin mRNA正?；?。引物用于PCR分析報告補(bǔ)充表S1。為分析Bcl2-A1 Taqman底漆和周期蛋白D1的表達(dá)式是應(yīng)用生物系統(tǒng)公司購買的。</p><p>　　轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞與lentiviral向量。短發(fā)卡RNA Lentiviral向量編碼(shRNA)針對人類Notch3或炒shRNA,作為一個控制,采購從西格瑪奧德里奇。向量股由瞬態(tài)三個質(zhì)粒載體包裝系統(tǒng)(如前所述。對

18、于MOLT-3或Jurkat轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞,200μL濃縮向量包含在靶細(xì)胞上清是分層的,被播種到12井文化板塊在1×106每好。在6到9 h在37°C,上層是替換為2毫升培養(yǎng)基。Notch3沉默的評估進(jìn)行了72小時后轉(zhuǎn)導(dǎo)。MOLT-3細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)Notch3 ICD得到父母MOLT-3細(xì)胞電穿孔與pcDNA3.1-Notch3ICD質(zhì)粒,其次是選擇在G418-containing介質(zhì)(500μg /毫升)。MOLT-3細(xì)胞

19、與pcDNA3.1-EGFP子轉(zhuǎn)染質(zhì)粒被用作控制。</p><p>　　統(tǒng)計分析。結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。統(tǒng)計分析的數(shù)據(jù)是采用t檢驗(yàn)。P < 0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計顯著性差異。</p><p><b>　　結(jié)果</b></p><p>　　notch配體DLL4只在生長的腫瘤中表達(dá)，休眠的腫瘤中無。之前的研究顯示人T0ALL M

20、OLT-3細(xì)胞缺乏生成腫瘤的潛能并一直在NOD/SCID鼠中保持休眠狀態(tài)，然而，這個細(xì)胞系的誘導(dǎo)劑MOLT-3-bFGF，有增強(qiáng)的血管形成因子bFGF，形成了惡性腫瘤。在孵育了2周后，dll4轉(zhuǎn)錄物表達(dá)，一個notch配體被內(nèi)皮細(xì)胞上的血管生成因子上調(diào)了，并且在腫瘤血管生成過程中同MOLT-3腫瘤比被MOLT-3-bFGF增加了。腫瘤溶解物的蛋白印跡分析證實(shí)這些差異并提出標(biāo)記的DLL4蛋白在生長腫瘤中早期的過表達(dá)。值得注意的是，DLL4

21、不是在體外的MOLT-3細(xì)胞中表達(dá)，也不是被bFGF誘導(dǎo)的，因此揭示了生長腫瘤中的高表達(dá)可能歸因于基質(zhì)成分。的確，在對生長腫瘤切片的熒光分析中，DLL4主要在內(nèi)皮細(xì)胞中檢測到，盡管一些CD31-細(xì)胞也表達(dá)DLL4。對比下，休眠腫瘤只在邊緣表達(dá)DLL4。當(dāng)Jurkat細(xì)胞被注射進(jìn)NOD/SCID鼠，有或沒有bFGF時也有類似的發(fā)現(xiàn)，因此顯示在bFGF誘導(dǎo)的血管生成過程中DLL4表達(dá)的上調(diào)不是MOLT-3腫瘤的唯一特點(diǎn)。</p>

22、<p>　　我們注射MOLT-3-bFGF細(xì)胞進(jìn)入用Matrigel填料的NOD/SCID鼠，然后在第2、5、14天收回樣本。為了評價灌流，小鼠在死前又立即被注射了Dextran 70-FITC。結(jié)果顯示少量的DLL4+細(xì)胞在被注射第2天的MOLT-bFGF團(tuán)塊中發(fā)現(xiàn)，隨后數(shù)量增加了。DLL4表達(dá)固定的領(lǐng)先于灌流，灌流僅在第14天的樣本中發(fā)現(xiàn)。這些發(fā)現(xiàn)暗示DLL4在腫瘤形成早期，血管網(wǎng)灌流之前的作用。</p>

23、<p>　　Notch3活化水平的升高時生長的MOLT-3腫瘤的特殊標(biāo)志。</p><p>　　在大腸癌腫瘤模型中，DLL4表達(dá)與升高的Notch分裂相關(guān)。MICOL-14細(xì)胞存活了，雖然在NOD/SCID鼠無腫瘤形成，如視覺成像技術(shù)和腫瘤大小測量所示。然而，它們的腫瘤形成變異體MICOL-14tum卻形成了惡性腫瘤。DLL4和CD31在休眠的MICOL-14腫瘤中幾乎探測不到，但在MICOL-14t

24、um細(xì)胞形成的5周的腫瘤中卻明顯發(fā)現(xiàn)。此外，一些CD31-的細(xì)胞液發(fā)現(xiàn)抗DLL4抗體。分裂的notch3在生長的腫瘤內(nèi)高，相反，notch1卻低于休眠腫瘤。總之，這些結(jié)果證實(shí)了DLL4表達(dá)是腫瘤血管生成的特征之一，并與腫瘤細(xì)胞的notch3活化水平增高有關(guān)。</p><p>　　T-ALL細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞共同培養(yǎng)觸發(fā)了notch3通路</p><p>　　其它的notch通路成分都被SIEC

25、細(xì)胞表達(dá)了，包括jagged1，jagged2和dll1，如前報道，然而，除了dll1，剩下的都不被bFGF/VEGF誘導(dǎo)。所有的實(shí)驗(yàn)都進(jìn)一步證實(shí)了DLL4可觸發(fā)notch通路。與SIEC后共同培養(yǎng)有保護(hù)效應(yīng)，延緩細(xì)胞凋亡。但加抗DLL4抗體后，這種效應(yīng)就被清除了。類似的情況也出現(xiàn)在MOLT-3細(xì)胞。它們說明了SIEC細(xì)胞能為在壓力情況下的T-ALL細(xì)胞提供與notch-dll4相互作用有關(guān)的存活信號。</p><p

26、>　　DLL4中和反應(yīng)抑制了腫瘤生長并減少了notch3活化。</p><p>　　向MOLT-3-bFGF腫瘤注射抗DLL4抗體，導(dǎo)致了腫瘤大小和質(zhì)量減少。</p><p>　　notch3水平的調(diào)節(jié)影響T-ALL細(xì)胞存活，和導(dǎo)致腫瘤形成。</p><p><b>　　討論</b></p><p>　　進(jìn)來很多研

27、究強(qiáng)調(diào)了DLL4在腫瘤血管形成的作用，顯示了DLL4阻斷的治療腫瘤的潛力。這里，我們首次研究了DLL4在腫瘤休眠的調(diào)節(jié)。我們之前發(fā)現(xiàn)T-ALL細(xì)胞缺乏血管生成并獲得了一個在NOD/SCID鼠的休眠表型，這種情況可被發(fā)送到腫瘤微環(huán)境的血管源性轉(zhuǎn)換信號打斷。最近，又在缺血管的CRC細(xì)胞發(fā)現(xiàn)了一些血管生成變異體，有增高的腫瘤生成潛力。這些CRC細(xì)胞表達(dá)notch受體，因此可用來進(jìn)一步研究notch通路上的血管生成效應(yīng)。通過實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，我們報道?/p>

28、休眠腫瘤缺乏DLL4表達(dá)，而惡性腫瘤有高DLL4表達(dá)，這和之前的研究相符。DLL4發(fā)現(xiàn)主要在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)。T-ALL細(xì)胞無DLL4表達(dá)，可能一些非內(nèi)皮基質(zhì)細(xì)胞也表達(dá)這種notch配體。一些DLL4+細(xì)胞液表達(dá)在巨噬細(xì)胞。關(guān)于DLL4表達(dá)的動力學(xué)研究，DLL4在體內(nèi)表達(dá)在腫瘤細(xì)胞注射之后很快就能檢測到，領(lǐng)先于血管網(wǎng)供養(yǎng)和營養(yǎng)物質(zhì)，支持了DLL4介導(dǎo)的notch信號通路在腫瘤形成早期也起作用。</p><p>　　

29、這個研究的主要發(fā)現(xiàn)時闡述了在腫瘤血管生成的微環(huán)境中notch配體DLL4的表達(dá)對腫瘤細(xì)胞notch3通路的調(diào)節(jié)作用。DLL4表達(dá)與notch3的活性水平之間在腫瘤中形成了強(qiáng)大的聯(lián)系，更重要的是，體內(nèi)dll4中和作用明顯抑制腫瘤細(xì)胞中notch通路也支持這個假說。此外，notch在T-ALL細(xì)胞的活化可被共同在內(nèi)皮細(xì)或固定的DLL重組體培養(yǎng)而觸發(fā)，被抗DLL抗體阻斷。盡管我們強(qiáng)調(diào)了DLL4在notch3活性調(diào)節(jié)的作用，但廣泛認(rèn)為有些not

30、ch受體和配體在內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)，使鄰近細(xì)胞和受體配體結(jié)合之間產(chǎn)生相互作用。因此，其他的notch配體，不只是DLL4，可能激活T-ALL細(xì)胞的notch途徑，這也許能解釋為什么DLL4中和反應(yīng)在體內(nèi)和體外都不阻止notch3活化。</p><p>　　有趣的是，當(dāng)notch1和notch3的活性形式都在白血病和大腸癌細(xì)胞中表達(dá)，腫瘤生成表型在兩種模型的獲得都與notch3信號選擇性上調(diào)有關(guān)。考慮到這兩個notc

31、h成員之間的交聯(lián)，休眠腫瘤中基礎(chǔ)notch3表達(dá)由notch1維持是可能的。notch1活性似乎T-ALL細(xì)胞存活的條件，這是由于notch1 ICD清除和notch1靶點(diǎn)基因HEY1-2在腫瘤細(xì)胞的表達(dá)，notch1沉默在T-ALL細(xì)胞存活力的陰性結(jié)果但還不足以和需要結(jié)合的notch1和notch3信號的惡性表型比較。notch1表達(dá)在大腸癌細(xì)胞里是下調(diào)的，由于一些未知原因，這可能說明在兩種模型分析中notch1在腫瘤生成有不同的作用

32、。在有T-ALL的病人，notch3表達(dá)非常普通，在這種腫瘤發(fā)現(xiàn)大約100%，包括分子和免疫表型。假設(shè)，在T-ALL的notch3活化可能是DLL4或其他在骨髓微環(huán)境notch配體表達(dá)引起。這樣一來，在三份淋巴瘤樣本T細(xì)胞微環(huán)境中發(fā)現(xiàn)DLL4表達(dá)顯得很重要，它是一種罕見的骨髓外有T-ALL類似物的淋巴瘤。</p><p>　　觸發(fā)notch3受體就像傳遞一個生存信號給T-ALL細(xì)胞。為了支持這種假設(shè)，我們發(fā)現(xiàn)升高