TLR4信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分泌MIP-3alpha參與腫瘤免疫逃逸的研究.pdf

1、慢性感染和炎癥被認(rèn)為是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生和發(fā)展的重要原因之一,研究證明促炎性細(xì)胞因子和趨化因子長(zhǎng)期存在于某部位可能會(huì)導(dǎo)致慢性炎癥的發(fā)生,局部微環(huán)境中促炎性細(xì)胞因子的長(zhǎng)期存在和反復(fù)的炎癥反應(yīng)可能誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生,但目前對(duì)于慢性炎癥導(dǎo)致腫瘤發(fā)生和發(fā)展的相關(guān)機(jī)制并不十分清楚.腫瘤免疫逃逸發(fā)生的機(jī)制一直是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一,近年來(lái)腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)與腫瘤免疫逃逸的關(guān)系倍受關(guān)注.

2、 我們?cè)O(shè)想腫瘤細(xì)胞是否可以通過分泌大量的趨化因子,進(jìn)而吸引更多的不成熟和/或具有免疫抑制性的細(xì)胞亞群進(jìn)入瘤內(nèi),繼而參與機(jī)體的免疫逃逸.MIP-3a(巨噬細(xì)胞炎癥蛋白)是屬于CC亞族的趨化因子,組成性表達(dá)在多種來(lái)源的上皮細(xì)胞,其特異性受體是CC-趨化因子受體6(CCR6),趨化淋巴細(xì)胞和DC.很多浸潤(rùn)大量非成熟DC的實(shí)體瘤本身都檢測(cè)到表達(dá)MIP-3a. 在以上研究背景和假設(shè)的基礎(chǔ)上,我們?cè)诒菊n題中選擇了幾株不同組織來(lái)源的小鼠

3、腫瘤細(xì)胞株作為研究對(duì)象,首先探討了腫瘤細(xì)胞表面TUR4的表達(dá)和誘導(dǎo)表達(dá);進(jìn)一步研究了TLR4信號(hào)對(duì)腫瘤細(xì)胞趨化因子表達(dá)譜的影響;分析了腫瘤細(xì)胞中的MIP-3a是否能夠被誘導(dǎo)表達(dá)以及與TLR4信號(hào)的相關(guān)性;最后對(duì)于調(diào)控MIP-3a分泌的相關(guān)信號(hào)通路以及MIP-3a究竟通過怎樣的機(jī)制促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和發(fā)展等做了初步的探討. 研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),多數(shù)腫瘤細(xì)胞如結(jié)腸癌細(xì)胞株C126、肺癌細(xì)胞株3LL、黑色素瘤細(xì)胞株B16和B16F10、纖維瘤細(xì)胞

4、株L929和乳腺癌細(xì)胞株4T1都組成性地表達(dá)TLR4且表達(dá)量較高,TLR4的天然配體LPS能上調(diào)CT26表達(dá)TLR4,但對(duì)其它幾種腫瘤細(xì)胞B16、4T1、3LL的TLR4的表達(dá)無(wú)明顯影響.隨后我們用RT-PCR方法檢測(cè)了TLR4信號(hào)對(duì)這四種腫瘤細(xì)胞趨化因子的表達(dá)譜的影響,結(jié)果顯示,LPS刺激后,四種腫瘤細(xì)胞某些免疫抑制性因子和趨化因子的表達(dá)變化不盡相同:在檢測(cè)的四種腫瘤細(xì)胞中均組成性表達(dá)MCP-1,L2S誘導(dǎo)后無(wú)明顯變化:RNATES在

5、兩種腫瘤細(xì)胞中(B16,CT26)組成性表達(dá),LPS誘導(dǎo)后無(wú)明顯變化,但12S刺激12h后在4T1腫瘤細(xì)胞中RNATES表達(dá)增加,而在3LL腫瘤細(xì)胞中,LPS卻下調(diào)RNATES表達(dá):趨化因子IP-10只有在4T1細(xì)胞中受LPS刺激后上調(diào)其表達(dá);L2S上調(diào)3LL細(xì)胞的VEGF的表達(dá)以及3LL和CT26中TECK的表達(dá);LPS上調(diào)3LL、B16、CT26細(xì)胞中MIP-3a的表達(dá),其中CT26細(xì)胞株的變化最為明顯.因TLR4信號(hào)對(duì)不同組織來(lái)源

6、的腫瘤細(xì)胞趨化因子表達(dá)譜的影響不盡相同,但MIP-3a的變化基本一致,MIP-3a是能夠顯著趨化不成熟DC和T細(xì)胞的重要趨化因子,腫瘤微環(huán)境中存在的TGF-β、vEGF、IL-8等大量抑制性細(xì)胞因子可阻滯DC的分化成熟,或者誘導(dǎo)分化為某些調(diào)節(jié)性DC.因此,我們推測(cè)TIR4信號(hào)是否可以通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞MIP-3a的分泌而參與機(jī)體的腫瘤免疫逃逸呢? TLR4信號(hào)能夠促進(jìn)小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞CT26分泌趨化因子MIP-3a.那么,其可能的分

7、子信號(hào)機(jī)制如何呢?首先我們對(duì)MAPKs和NF-κB兩條信號(hào)途徑進(jìn)行研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn),結(jié)腸癌細(xì)胞CT26在靜息狀態(tài)下MAPKs激酶中p38、ERK1/2和JNK1/2信號(hào)分子的磷酸化水平表達(dá)不高,LPS的刺激后,這三種信號(hào)分子的磷酸化水平都顯著增加.同樣地,LPS的刺激后的小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞CT26中NF-κB信號(hào)途徑也被激活,表現(xiàn)在胞漿內(nèi)磷酸化的IκBa降解及核內(nèi)NF-κB蛋白表達(dá)增高.但究竟是哪條或哪些通路參與了LPS誘導(dǎo)的MIP-3a的分

8、泌呢?我們利用相關(guān)信號(hào)分子特異性的抑制劑SB203580、U0126、SP600125和PDTC分別阻斷p38、ERK1/2、JNK1/2和NF-κB信號(hào)通路后,ELISA檢測(cè)MIP-3a的分泌量,結(jié)果顯示ERK1/2和NF-κB特異性的抑制劑U0126和PDTC明顯抑制了LPS誘導(dǎo)的MIP-3a的分泌,可推斷ERK和NF-κB信號(hào)通路的活化與CT26分泌MIP-3a直接相關(guān);有趣的是,研究結(jié)果顯示JNK抑制劑SP600125不但沒有阻

9、斷MIP-3a的分泌,反而促進(jìn)了MIP-3a分泌,那么,其相關(guān)機(jī)制怎樣呢?我們推測(cè)SP600125是否可能通過激活ERK和NF-kB信號(hào)通路,從而促進(jìn)了MIF-3a的分泌.因此,我們進(jìn)一步檢測(cè)了JNK抑制劑SP600125作用后CT26細(xì)胞內(nèi)ERK和p-IKB的活化情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn),JNK抑制劑明顯激活ERK的磷酸化水平,但對(duì)p-IKB的磷酸化水平并沒有明顯影響,表明JNK抑制劑可以通過活化ERK信號(hào)通路促進(jìn)MIP-3a分泌增加.

10、 以上研究結(jié)果顯示,TLR4信號(hào)可以通過激活ERK和NF-KB信號(hào)通路,增加腫瘤細(xì)胞MIP-3a的分泌.那么,MIP-3a的分泌如何參與TKR4信號(hào)介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞免疫逃逸?近年來(lái)大量文獻(xiàn)報(bào)道MIP-3a能趨化不成熟DC,并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng).為了闡明TLR4.信號(hào)介導(dǎo)MIP-3a的分泌是否參與結(jié)腸癌細(xì)胞CT26的免疫逃逸,我們首先利用Transwell系統(tǒng)檢測(cè)了MIP-3a對(duì)非成熟DC(immatureDC,imDC)的趨化作用,CT2

11、6細(xì)胞經(jīng)LPS刺激和未刺激,在第36小時(shí)收集培養(yǎng)上清,重組MIP-3a蛋白100ng/ml作為陽(yáng)性對(duì)照.結(jié)果發(fā)現(xiàn),LPS刺激的CT26腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)非成熟DC的趨化作用顯著高于未刺激細(xì)胞的培養(yǎng)上清,且趨化非成熟DC的細(xì)胞數(shù)量與陽(yáng)性對(duì)照組相當(dāng),為了明確腫瘤培養(yǎng)上清MIP-3a的作用,我們利用抗MIP-3a的中和性抗體100ug/ml對(duì)MIP-3a進(jìn)行阻斷,結(jié)果顯示,MIP-3a的中和性抗體阻斷組顯著降低了腫瘤培養(yǎng)上清對(duì)非成熟DC的趨化

12、作用,進(jìn)一步證實(shí)腫瘤培養(yǎng)上清中MIP-3a在趨化非成熟DC過程中發(fā)揮了重要作用.有文獻(xiàn)報(bào)道,趨化因子的存在可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)展,某些趨化因子能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖,從而增進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng).MIP-3a是否能夠直接促進(jìn)CT26腫瘤細(xì)胞的增殖呢?我們用CFSE標(biāo)記CT26細(xì)胞,用不同濃度L2S在不同時(shí)間點(diǎn)刺激后,FACS檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況,結(jié)果顯示,在LPs的不同作用時(shí)間點(diǎn)、各濃度的12S對(duì)CT26的增殖并沒有明顯的促進(jìn)作用. 綜上所述,腫