豬圓環(huán)病毒Ⅱ型ORF2和豬Il-2基因重組豬偽狂犬病毒的構(gòu)建.pdf

1、豬圓環(huán)病毒(Porcinecircovirus，PCV)是迄今為止發(fā)現(xiàn)的一種最小的動(dòng)物病毒，其基因組為單股環(huán)狀DNA，病毒粒子無囊膜，呈二十面體對(duì)稱。PCV分為PCV1和PCV2兩種基因型。豬圓環(huán)病毒病(PCVAD)自二十世紀(jì)九十年代初期首次報(bào)道以來，美國、法國、日本、韓國等國家相繼報(bào)道該病的發(fā)生，目前該病已成為世界范圍內(nèi)危害嚴(yán)重的疾病之一。PCV2除引起豬體發(fā)生原發(fā)感染甚至死亡之外，還侵害豬的免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致免疫抑制，繼發(fā)其他的細(xì)菌或病

2、毒感染，使疫情加重，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，本研究以編碼PCV2核衣殼蛋白的ORF2基因?yàn)檠芯繉?duì)象，以偽狂犬病毒弱毒疫苗株HB98株為親本毒，構(gòu)建了表達(dá)ORF2和IL-2基因的重組偽狂犬病毒，為探索開發(fā)PCV2重組疫苗奠定基礎(chǔ)，從而為生產(chǎn)上PCV2的防治提供新的思路和理論依據(jù)。
　　 本研究根據(jù)GenBank中已發(fā)表的PRV基因序列，設(shè)計(jì)并合成了一對(duì)特異性引物，采用PCR方法擴(kuò)增PRV基因，并將其進(jìn)行克隆和測(cè)序。

3、對(duì)偽狂犬病病毒閩A株基因組DNA3.1kb片段的質(zhì)粒pMD-PD用ShpI和KpnI消化，將含gG全基因及其上游pK基因、下游gD基因部分編碼區(qū)約2.8kb的片段亞克隆到載體pUC19中，獲得重組質(zhì)粒PUPD。以pcDNA3.1為模板，通過PCR擴(kuò)增約0.3kb的SV40Poly(A)片段，并將其克隆到質(zhì)粒PUPDBamHI和PstI位點(diǎn)，構(gòu)建重組質(zhì)粒PUPDS。
　　 通過酶切、補(bǔ)平、連接的方法對(duì)PUPDS和pEGFP-n1載

4、體質(zhì)粒進(jìn)行改造，消除了質(zhì)粒PUPDS上的HindⅢ酶切位點(diǎn)，將改造后的質(zhì)粒PUPDS命名為PH。并消除了質(zhì)粒pEGFP-n1上的BamHI和PstI酶切位點(diǎn)，將改造后的質(zhì)粒pEGFP-n1命名為pEGFP-P。根據(jù)pEGFP-n1基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，分別在引物的上、下游5’端引入了PstI酶切位點(diǎn)，以質(zhì)粒pEGFP-P為模版，通過PCR擴(kuò)增技術(shù)將目的基因EGFP(包括GFP、CMV、MCS、SV40Poly(A))克隆入pMD18-T

5、載體內(nèi)，構(gòu)建了重組質(zhì)粒。經(jīng)酶切和PCR鑒定證明插入片段是EGFP基因，并將重組質(zhì)粒命名為pMD-EGFP。用PstI酶切重組質(zhì)粒pMD-EGFP和載體PH并回收，將載體PH去磷酸化后與目的片斷EGFP連接，通過PCR擴(kuò)增、酶切、序列測(cè)定，證實(shí)該轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建成功，并將其命名為PG。
　　 用BamHI酶切克隆有ORF2基因的質(zhì)粒538-ORF2和載體PG質(zhì)粒并回收，將載體PG去磷酸化后與目的片段ORF2基因連接，構(gòu)建了重組質(zhì)粒PG

6、O。通過PCR擴(kuò)增、酶切、序列測(cè)定證明，該轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建成功。經(jīng)酶切鑒定證明插入片斷是ORF2基因片斷，并證明插入方向正確。以pIRES-pIL2為模板，通過PCR擴(kuò)增約0.5kb的豬IL-2全基因，并將其克隆到質(zhì)粒PGO中，構(gòu)建重組質(zhì)粒PGOIL2。然后再將該質(zhì)粒與PRV基因缺失株HB98株基因組共轉(zhuǎn)染ST細(xì)胞，通過同源重組，構(gòu)建了同時(shí)表達(dá)PCV2ORF2基因和豬IL-2基因的重組偽狂犬病毒株。經(jīng)熒光檢測(cè)和PCR鑒定，結(jié)果表明重組病毒構(gòu)