豬偽狂犬病毒、細(xì)小病毒和圓環(huán)病毒2型多重SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)PCR檢測方法的建立.pdf

1、豬偽狂犬病毒(porcine pseudorabies virus，PRV)、豬細(xì)小病毒(porcine parvovirus，PPV)和豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus type2，PCV2)是引起母豬繁殖障礙的3種主要病原體；豬偽狂犬病毒可引起家畜以及多種野生動物發(fā)熱、奇癢和急性腦脊髓炎等神經(jīng)癥狀，妊娠母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎或木乃伊胎；豬細(xì)小病毒感染可引起母豬流產(chǎn)、不孕，胚胎死亡、胎兒畸形、胎兒木乃伊化等，同時(shí)還可引起

2、仔豬的皮炎和腹瀉；豬圓環(huán)病毒2型可引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)，母豬繁殖障礙，皮炎及腎病綜合征、腸炎等。
　　 目前，針對以上3種病毒病的診斷方法有很多，這些方法具有操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、敏感度差及陰性率高等缺點(diǎn)；臨床已經(jīng)使用的PCR診斷技術(shù)，雖然有靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速、簡便等優(yōu)點(diǎn)，但不能準(zhǔn)確定量；基于TaqMan技術(shù)熒光定量PC

3、R方法能定量，但是成本較高，且需要合成特異性探針。亟需研究和開發(fā)簡便、快速、特異、成本低、定量的檢測方法。SYBR Green是非特異性結(jié)合于雙鏈DNA的熒光染料，可以和多種擴(kuò)增序列結(jié)合。在此基礎(chǔ)上建立的SYBR Green real-time PCR與TaqMan熒光定量PCR相比，可能由于檢測到非特異性的熒光信號；但可以通過溶解曲線分析來簡單、直接擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。SYBR Green real-time PCR可以不用設(shè)計(jì)和合成特

4、異的熒光標(biāo)記的探針直接擴(kuò)增檢測任何基因的技術(shù)。為此，做了以下研究：
　　 （一）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出豬偽狂犬病毒gH基因中187bp的片段，并克隆到pGEMT載體上，純化的質(zhì)粒作為PCR檢測的標(biāo)準(zhǔn)模板，以10倍梯度稀釋質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)模板，進(jìn)行SYBRGreenⅠ熒光定量PCR擴(kuò)增并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立了豬偽狂犬病毒的熒光定量PCR檢測方法。該方法檢測靈敏度可達(dá)126拷貝/μl，與豬圓環(huán)病毒，豬細(xì)小病毒，豬繁殖與呼吸綜合征病毒，豬瘟病毒

5、不發(fā)生交叉反應(yīng)，具有良好的特異性和重復(fù)性；對15份疑似病料進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)均為熒光定量PCR陽性，而常規(guī)PCR只能檢測出6份陽性。結(jié)果表明：建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR具有特異、敏感、快速、定量、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，可用于臨床PRV感染的檢測。
　　 （二）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出豬細(xì)小病毒VP2保守區(qū)基因194bp片段，并克隆到pGEMT載體上，純化后以10倍梯度稀釋的質(zhì)粒作為PCR檢測的標(biāo)準(zhǔn)模板，進(jìn)行SYBR GreenⅠ熒光定量PCR

6、擴(kuò)增并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立了豬細(xì)小病毒的熒光定量PCR檢測方法。靈敏度可達(dá)100拷貝/μl，與豬圓環(huán)病毒，豬繁殖與呼吸綜合癥病毒，豬乙型腦炎病毒，豬偽狂犬病毒，豬瘟病毒和豬流感病毒不發(fā)生交叉反應(yīng)，具有良好的特異性和重復(fù)性；對10份疑似病料進(jìn)行了檢測，均為陽性，而常規(guī)PCR只檢測出7份陽性。結(jié)果表明：建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法具有特異、敏感、快速、定量、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，可用于臨床PPV感染的檢測。
　　 （三）根據(jù)已報(bào)道的豬圓環(huán)病

7、毒2型ORF2基因組序列，設(shè)計(jì)并合成1對引物。通過常規(guī)PCR擴(kuò)增豬圓環(huán)病毒2型ORF2中一段保守序列，經(jīng)克隆后轉(zhuǎn)化到DH5α中。提取重組質(zhì)粒，經(jīng)PCR及測序鑒定后，作為陽性模板建立SYBRGreenⅠ熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，并做靈敏性試驗(yàn)、特異性試驗(yàn)和重復(fù)性試驗(yàn)。結(jié)果表明：標(biāo)準(zhǔn)曲線循環(huán)閾值與模板濃度呈良好的線性關(guān)系，溶解曲線特異，相關(guān)系數(shù)為0.9988，靈敏度為35拷貝/μl，特異性和重復(fù)性較好。試驗(yàn)建立了檢測豬圓環(huán)病毒2型的SYBR

8、GreenⅠ熒光定量PCR方法，為該病的早期診斷，并定量分析豬圓環(huán)病毒感染程度奠定了基礎(chǔ)。
　　 （四）利用已報(bào)道的豬偽狂犬病毒的gH基因序列和豬細(xì)小病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1序列保守區(qū)域，分別設(shè)計(jì)并合成1對引物，通過常規(guī)PCR擴(kuò)增，經(jīng)克隆后轉(zhuǎn)化到DH5α中。以純化后的重組質(zhì)粒作為模板建立了能夠同時(shí)檢測豬偽狂犬病毒和豬細(xì)小病毒的SYBRGreenⅠ實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)。通過對該方法的靈敏度、特異性和重復(fù)性分析發(fā)現(xiàn)，能最少檢測160拷貝豬

9、偽狂犬病毒質(zhì)粒和248拷貝豬細(xì)小病毒質(zhì)粒；不能檢測出豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬乙型腦炎病毒。試驗(yàn)表明：所建立的SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)能夠同時(shí)檢測這2種病毒，為快速診斷這2種疾病提供技術(shù)支持。
　　 （五）利用已報(bào)道的豬偽狂犬病毒的gH基因序列和豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因組序列，分別設(shè)計(jì)并合成1對引物，通過常規(guī)PCR擴(kuò)增，經(jīng)克隆后轉(zhuǎn)化到DH5α中。以純化后的重組質(zhì)粒作為模板建立了能夠同時(shí)檢測豬偽狂犬病毒

10、和豬圓環(huán)病毒2型的SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)。通過對該方法的靈敏度、特異性和重復(fù)性分析發(fā)現(xiàn)，能最少檢測180拷貝豬偽狂犬病毒質(zhì)粒和215拷貝豬圓環(huán)病毒2型質(zhì)粒；不能檢測出豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬乙型腦炎病毒。試驗(yàn)表明：所建立的SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)能夠有效診斷和檢測這2種病毒，有利于這2種疾病的早期鑒別診斷。
　　 （六）根據(jù)已報(bào)道的豬細(xì)小病毒VP2保守區(qū)基因序列和豬圓環(huán)病毒2型ORF

11、2基因組序列，分別設(shè)計(jì)并合成1對引物，通過常規(guī)PCR擴(kuò)增，經(jīng)克隆后轉(zhuǎn)化到DH5α中。以純化后的重組質(zhì)粒作為模板建立了能夠同時(shí)檢測豬細(xì)小病毒和豬圓環(huán)病毒2型的SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)。通過對該方法的靈敏度、特異性和重復(fù)性分析發(fā)現(xiàn)，該方法能最少檢測175拷貝豬細(xì)小病毒質(zhì)粒和156拷貝豬圓環(huán)病毒2型質(zhì)粒；不能檢測出非特異的豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬乙型腦炎病毒。試驗(yàn)表明：此方法能夠有效診斷和檢測這2種病毒，也為這2種

12、疾病的治療提供了技術(shù)檢測手段。
　　 （七）利用已報(bào)道的豬細(xì)小病毒VP2保守區(qū)基因序列、豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因組序列和豬偽狂犬病毒的gH基因序列，分別設(shè)計(jì)并合成1對引物，通過常規(guī)PCR擴(kuò)增，經(jīng)克隆后轉(zhuǎn)化到DH5α中。以純化后的重組質(zhì)粒作為模板建立了能夠同時(shí)檢測豬細(xì)小病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬偽狂犬病毒多重SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)。通過對所建立的PCR方法的靈敏度、特異性和重復(fù)性分析發(fā)現(xiàn)，該方法能最少檢測189拷