中華絨螯蟹蛻皮激素調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)、純化及鑒定.pdf

1、中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)，中國甲殼類動物重要養(yǎng)殖物種之一。目前，中華絨螯蟹的養(yǎng)殖業(yè)隨著世界市場的需求逐漸成為我國一個重要的支柱產(chǎn)業(yè)，但由于中國水產(chǎn)養(yǎng)殖的密集化發(fā)展，使得養(yǎng)殖過程中中華絨螯蟹經(jīng)?；忌嫌筛鞣N病毒和細(xì)菌所引發(fā)的疾病以及出現(xiàn)大量性早熟和種質(zhì)退化等現(xiàn)象，這些都已經(jīng)對中華絨螯蟹的養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)生了重創(chuàng)，同時這些問題已經(jīng)成為了該蟹養(yǎng)殖業(yè)停滯不前的瓶頸之一。在科研人員對中華絨螯蟹飼養(yǎng)條件改良后其產(chǎn)量效果仍不佳的情況下

2、，研究人員開始從分子生物學(xué)的角度來對這些問題進(jìn)行探討研究。大量研究發(fā)現(xiàn)，中華絨鰲蟹體內(nèi)的蛻皮激素參與了與蛻皮發(fā)育有關(guān)的各種活動，而與蛻皮激素有關(guān)的蛻皮激素調(diào)節(jié)蛋白被發(fā)現(xiàn)有可能參與了該蟹發(fā)育過程中的蛻皮級聯(lián)反應(yīng)。由于中華絨螯蟹中的性早熟和蛻皮未遂等現(xiàn)象與該蟹的蛻皮過程密切相關(guān)，因此研究該蟹的蛻皮相關(guān)基因?qū)鉀Q該蟹在養(yǎng)殖方面出現(xiàn)的問題有重要的意義。本次研究就試圖從分子生物學(xué)的角度來對中華絨螯蟹中與蛻皮激素有關(guān)的蛻皮激素調(diào)節(jié)蛋白進(jìn)行研究，以期

3、能進(jìn)一步深入了解中華絨螯蟹蛻皮過程的機(jī)理，解決養(yǎng)殖過程中的瓶頸問題以及進(jìn)一步地推動我國中華絨螯蟹養(yǎng)殖業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展。
　　本次研究首次以GST融合蛋白的形式來克隆、表達(dá)以及純化蛻皮激素調(diào)節(jié)蛋白。首先利用生物信息學(xué)軟件對蛻皮激素調(diào)節(jié)基因進(jìn)行序列分析，從理論上得知該基因的一些基本信息，包括該基因的cDNA序列分析、氨基酸序列分析、蛋白功能域預(yù)測以及基因編碼的氨基酸的同源性比對和分子進(jìn)化分析。在獲知該基因以及該蛋白質(zhì)的一些基本信息后，首先

4、從中華絨螯蟹體內(nèi)獲得成熟的eDNA片段，然后運(yùn)用PCR技術(shù)獲得該基因的開放閱讀框，之后通過目前世界上比較先進(jìn)的同源重組技術(shù)獲得一個可以有效表達(dá)融合蛋白的pGEX-4T-1-Esr重組質(zhì)粒，在大腸桿菌中成功表達(dá)該蛋白后，再運(yùn)用一系列純化柱，包括GST親和層析柱，Mono Q陰離子交換柱以及Hiload Superdex75分子篩等對此融合蛋白進(jìn)行純化。在純化過程中，每個步驟都能去除掉大量的雜蛋白，在分子篩之后，基本獲得了單一的蛻皮激素調(diào)節(jié)