中華絨螯蟹腦組織促性腺釋放激素類似物分離、免疫定位及功能鑒定.pdf

1、卵母細胞在完成卵黃積累后,減數(shù)分裂重啟,進入最后的生理(減數(shù)分裂)成熟階段,只有達到最后的生理成熟,卵母細胞才能正常排卵、受精。卵母細胞最終成熟以生發(fā)泡破裂(germinal vesicle break down，GVBD)為標志,在脊椎動物,卵母細胞最終成熟受下丘腦分泌的促性腺釋放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)調(diào)控,GnRH通過刺激垂體釋放卵泡刺激素(follicle stimulati

2、ng hormone，F(xiàn)SH)、黃體生成素(luteinizing hormone，LH),誘發(fā)GVBD,導致卵母細胞成熟,但在蝦蟹類甲殼動物是否存在類似調(diào)控通路尚不清楚。
　　本研究以我國重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖動物中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)為研究對象,應(yīng)用反向高效液相色譜法(RP-HPLC)從中華絨螯蟹腦組織提取液分級分離了GnRH類似物,使用章魚促性腺釋放激素抗體(anti-octGnRH)對分離組分進行免疫斑

3、點印跡實驗鑒定,獲得了高純度免疫反應(yīng)呈陽性GnRH類似物分離組分,對該 GnRH類似物進行基質(zhì)輔助激光解吸/電離串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF/TOF MS)分析,結(jié)果表明,蟹腦組織中GnRH類似物具有兩個亞型,均為十一肽,即QSYHFSHGWKP與QAYHFSHGWKP,分別命名為EsGnRH-Ⅰ和EsGnRH-Ⅱ,分子量為1356.6Da與1373.6D。與其他物種30種 GnRH類型進行比對顯示中華絨螯蟹 GnRH類似物氨基

4、酸序列具有GnRH家族相同氨基酸保守位點,其中 Q1、H4、S6、G8、P11五個氨基酸位點與脊椎動物的GnRH-Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型完全相同,W9位點與脊椎動物GnRH-Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型相完全一致。同時該類似物具有無脊椎動物GnRH典型結(jié)構(gòu),即與脊椎動物類似物相比在第一位氨基酸后同樣多插入了兩個氨基酸,并且具有無脊椎動物相一致的F5位點,特別是其中一種亞型與與海生蠕蟲 GnRH僅在第十位氨基酸有差異。隨后根據(jù)獲得多肽序列,制備兔抗中華絨螯

5、蟹GnRH類似物抗體(anti-EsGnRH),使用anti-EsGnRH進行腦組織免疫組化分析,結(jié)果表明,在前腦的第8與11號細胞群中發(fā)現(xiàn)中型與小型細胞的細胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)免疫陽性物質(zhì),并且在中腦第10號細胞群發(fā)現(xiàn)小型細胞的細胞質(zhì)中有免疫陽性物質(zhì),最后在嗅葉外周的小型細胞的細胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)免疫陽性物質(zhì)。在后腦部位雖然沒有發(fā)現(xiàn)免疫陽性細胞群,但是在連接后腦和胸神經(jīng)節(jié)的食道下神經(jīng)節(jié)以及第二觸角神經(jīng)纖維中發(fā)現(xiàn)免疫陽性物質(zhì)分布在神經(jīng)束中,表明GnRH分

6、泌后可能通過這兩條神經(jīng)通道運輸?shù)桨屑毎课?對卵母細胞最終成熟過程產(chǎn)生影響。為了進一步驗證這一推斷,根據(jù)氨基酸序列人工合成中華絨螯蟹EsGnRH-Ⅰ、EsGnRH-Ⅱ,通過活體注射人工合成GnRH進行誘導卵母細胞成熟實驗,結(jié)果表明,單獨注射時這兩種亞型均可促進卵母細胞 GVBD發(fā)生,與空白對照組相比均具有顯著性差異(P<0.05),特別是EsGnRH-Ⅰ注射組在500ng/ml時效果最為明顯,GVBD比例為40％,與空白對照組相比具有極

7、顯著性差異(P<0.01)。兩種亞型同時注射與單獨注射效果相同,沒有表現(xiàn)出協(xié)同作用。在脊椎動物中 GnRH末端均存在高度保守甘氨酸(Gly,G)位點,為了驗證該位點對EsGnRH活性的影響,人工合成添加G的突變體(EsGnRH1-12),與空白對照組相比GVBD比例并沒有顯著性差異(P>0.05),說明肽段末端添加的G對EsGnRH活性并無影響。這些實驗不僅證實中華絨螯蟹GnRH具有與脊椎動物相似功能,同時表明在甲殼動物中確實存在腦-性