犬吉氏巴貝斯蟲(chóng)重組表達(dá)抗原檢測(cè)技術(shù)的建立及其在流行病學(xué)調(diào)查上的應(yīng)用.pdf

1、吉氏巴貝斯蟲(chóng)病是由寄生在犬紅細(xì)胞內(nèi)一種蜱傳吉氏巴貝斯蟲(chóng)原蟲(chóng)所致，犬表現(xiàn)發(fā)熱、貧血、血紅蛋白尿和消瘦，甚至死亡，是我國(guó)最常見(jiàn)的犬梨形蟲(chóng)?。ń瓜x(chóng)）的病原之一。吉氏巴貝斯蟲(chóng)病在我國(guó)多個(gè)省市均有報(bào)道，但其系統(tǒng)流行病學(xué)和臨床病理特征缺乏研究;診斷主要依賴于血液涂片鏡檢，但這種方法對(duì)于紅細(xì)胞染蟲(chóng)率低的非急性感染診斷困難，也不適合樣本數(shù)量大的流行病學(xué)研究。因此，開(kāi)發(fā)一種特異性及敏感性較高的血清學(xué)診斷試劑，對(duì)巴貝西斯蟲(chóng)流行病學(xué)調(diào)查及小動(dòng)物臨床診斷具有重

2、要的意義。本研究建立了基于截短型重組抗原（tBgTRAP）的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)技術(shù)，應(yīng)用該方法對(duì)來(lái)自南京、上海、無(wú)錫、杭州和鄭州等地區(qū)不同犬血樣進(jìn)行檢測(cè)，得出犬吉氏巴貝斯蟲(chóng)病流行病學(xué)的初步數(shù)據(jù)。此外，通過(guò)61例臨床吉氏巴貝斯蟲(chóng)感染犬血液學(xué)及生化指標(biāo)的分析，研究其臨床癥狀、診斷及其病理學(xué)特征，為臨床診斷和治療提供支持。
　　1犬吉氏巴貝斯BgTRAP蛋白重組表達(dá)及其ELISA診斷應(yīng)用價(jià)值
　　吉氏巴貝斯蟲(chóng)BgT

3、RAP蛋白是一個(gè)重要的診斷抗原候選分子。為了基于該抗原建立實(shí)用的血清學(xué)診斷方法，選取C-末端跨膜區(qū)前，包含TSP功能區(qū)和抗原區(qū)的氨基酸所編碼基因片段，重組表達(dá)了一個(gè)可溶性截短型BgTRAP抗原，解決了完整蛋白重組表達(dá)純化的困難。免疫熒光試驗(yàn)表明，截短型抗原具有良好的抗原性。純化的截短型抗原作為酶聯(lián)免疫試驗(yàn)診斷抗原可清晰地區(qū)分陰性及陽(yáng)性犬血清，并與其他病原感染無(wú)交叉反應(yīng)，顯示其診斷的特異性。犬感染吉氏巴貝斯蟲(chóng)系列血清檢測(cè)表明，該抗原可檢測(cè)

4、早期感染(4d)和感染200d以后的樣本，顯示其適合感染早期和慢性持續(xù)感染的診斷。結(jié)果表明:重組BgTRAP截短型抗原可作為一種診斷制劑檢測(cè)犬吉氏巴貝斯蟲(chóng)抗體。
　　2南京、無(wú)錫、上海及杭州地區(qū)犬吉氏巴貝斯蟲(chóng)病血清學(xué)調(diào)查
　　應(yīng)用基于BgTRAP截短型抗原的ELISA方法，對(duì)來(lái)自南京地區(qū)、無(wú)錫地區(qū)、上海地區(qū)及杭州地區(qū)2011～2012年就診犬的總計(jì)705份血樣進(jìn)行犬吉氏巴貝斯蟲(chóng)病的血清學(xué)調(diào)查。結(jié)果顯示南京地區(qū)、無(wú)錫地區(qū)、上海

5、地區(qū)及杭州地區(qū)門(mén)診犬吉氏巴貝斯蟲(chóng)感染的血清學(xué)陽(yáng)性率為分別為20.09％，3.03％，3.37％和0.00％，說(shuō)明吉氏巴貝斯蟲(chóng)感染存在明顯的地區(qū)差異。進(jìn)一步對(duì)南京地區(qū)犬樣本進(jìn)行詳細(xì)分析，我們發(fā)現(xiàn)巴貝西蟲(chóng)感染的臨床發(fā)病率為僅為8.33％(17/204)，顯示本病存在一定的隱性感染率或漏診率;工作犬的吉氏巴貝斯蟲(chóng)陽(yáng)性率達(dá)47.05％，明顯高于寵物犬20.09％的陽(yáng)性率;在年齡上，陽(yáng)性犬在2～6歲占70.73％，說(shuō)明犬的活動(dòng)性與感染有相關(guān)性;感

6、染季節(jié)上，春、夏、秋、冬的陽(yáng)性率分別為23.07％、16％、34.09％和10.34％，表明春秋二季是主要感染季節(jié)，這點(diǎn)與媒介硬蜱活動(dòng)規(guī)律一致。使用tBgTRAPELASA檢測(cè)表明，南京地區(qū)吉氏巴貝斯蟲(chóng)陽(yáng)性率明顯高于上海、無(wú)錫地區(qū);杭州地區(qū)未檢測(cè)到陽(yáng)性樣本。南京地區(qū)工作犬吉氏巴貝斯蟲(chóng)陽(yáng)性率明顯高于普通犬，說(shuō)明該寄生蟲(chóng)對(duì)工作犬危害高于普通犬。因此，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)寵物犬尤其工作犬的蜱蟲(chóng)預(yù)防和環(huán)境控制，降低巴貝斯蟲(chóng)對(duì)犬的危害，進(jìn)而控制本病在南京地區(qū)

7、的季節(jié)性流行。
　　3鄭州地區(qū)比特斗犬吉氏已貝斯蟲(chóng)病的血清學(xué)調(diào)查
　　應(yīng)用基于BgTRAP截短型抗原的ELISA方法，檢測(cè)了鄭州地區(qū)三個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)共計(jì)171只比特犬樣本，總的血清陽(yáng)性率是38％(65/171)，但陽(yáng)性犬發(fā)病率僅為24.61％(16/65)，表明與普通犬感染吉氏巴貝西類似，多數(shù)為亞臨床感染。感染后康復(fù)犬復(fù)發(fā)率為43％(7/16)。1歲以下陽(yáng)性率為4.6％(3/65)，1～5歲比特犬陽(yáng)性率為92.3％(60/65);

8、5歲以上陽(yáng)性率為3.10％(2/65)。陽(yáng)性犬中公犬占76.9％(50/65)，母犬占23.1％(15/65)。A犬場(chǎng)為大型比特犬養(yǎng)殖場(chǎng)，血清陽(yáng)性率為26.72％(35/131)，陽(yáng)性犬發(fā)病率為17％(6/35)，復(fù)發(fā)率為33.33％(2/6)。B、C犬場(chǎng)為斗犬愛(ài)好者養(yǎng)殖戶，吉氏巴貝斯陽(yáng)性率分別為85.7％(12/14)和69.2％(18/26)，B、C犬場(chǎng)巴貝斯陽(yáng)性犬發(fā)病率分別為21.42％(3/14)和22.22％(6/26)，顯示

9、吉氏巴貝斯有較高的隱性感染率;B、C犬場(chǎng)吉氏巴貝斯復(fù)發(fā)率為66.66(2/3)和復(fù)發(fā)率為50％(3/6)，表明部分病例不能根治，治療方法還有待改進(jìn)。96.9％(63/65)的陽(yáng)性犬有咬斗史，98％(64/65)陽(yáng)性犬有被咬傷疤痕，表明其主要傳播途徑為血液傳播。吉氏巴貝斯蟲(chóng)在比特斗犬品種中廣泛傳播，陽(yáng)性率、發(fā)病率及復(fù)發(fā)率都很高，說(shuō)明吉氏巴貝斯蟲(chóng)在比特犬群中隱性感染或康復(fù)帶蟲(chóng)率較高。其主要傳播途徑為咬傷后的血液傳播，其他感染途徑可能為經(jīng)胎盤(pán)

10、垂直傳播。比特犬作為儲(chǔ)蟲(chóng)宿主及其種群成為吉氏巴貝斯蟲(chóng)的儲(chǔ)蟲(chóng)庫(kù)在傳播巴貝斯蟲(chóng)路徑中扮演重要角色
　　461個(gè)吉氏巴貝斯蟲(chóng)病例的臨床特征、臨床病理學(xué)特征及診斷分析
　　對(duì)來(lái)自南京市三家動(dòng)物醫(yī)院的61例確診為吉氏巴貝西斯蟲(chóng)感染病例的臨床特征及血液學(xué)分析結(jié)果為:體溫分布不一。體溫升高的占48.78％(20/41)，體溫正?；蚱偷恼?1.22％(21/41)。食欲減退的占100％，精神沉郁至嗜睡的占100％，黏膜蒼白的占87.8％(

11、37/41)，重度到重度蒼白的占80.48％(33/41)。黃疸表現(xiàn)為輕度黃疸，比例為39.02％(16/41);脾腫大的95％(39/41)，中度到重度腫大的為75(75％)。貧血的分布為:輕度貧血的(37＜HCT＞25)為9.7％、中度貧血的(25＜HCT＞15)為34％及嚴(yán)重貧血的(HCT＜15)分別為9.7％、34％及46％。總的貧血比例為90.2％(37/41)。MCHC低于正常范圍下限的為73％(30/41)。95％(39/

12、41)的病例血小板數(shù)降低。血小板輕度降低(175＜PLT＞100)、血小板中度降低(100＜PLT＞50)及血小板嚴(yán)重降低(PLT＜50)分別為21.95％(9/41),21.95％(9/41)及51.21％(21/41)。
　　對(duì)30個(gè)吉氏巴貝西斯蟲(chóng)病血涂片的染蟲(chóng)率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果為:染蟲(chóng)率為0.5％-0.8％的為占23.33％(7/30)，染蟲(chóng)率1％-5％的占66.66％(20/30)，染蟲(chóng)率5％-30％為占10％(3/30)。球形

13、紅細(xì)胞，多染紅細(xì)胞，低染性大紅細(xì)胞為血液細(xì)胞學(xué)主要特征。
　　對(duì)20例確診為吉氏巴貝西斯蟲(chóng)感染病例生化指標(biāo)的結(jié)果進(jìn)分析顯示:65％(13/20)的病例總膽紅素(T-BIL)升高，30％(6/20)的病例總膽紅素超過(guò)正常范圍的50％，主要與溶血有關(guān);有45％病犬(9/20)ALT升高，有25％(5/20)ALT/AST/ALP值同時(shí)升高，表明1/5病例肝細(xì)胞受損;有20％(4/20)CRE，BUN同時(shí)高于正常范圍，表明1/4病例出現(xiàn)